髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 16, 2011 Vol.15, No.29

丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨★　杨 耀1，徐卫袁2，张 亚3，张兴祥2，刘宗宝2，钱 辉2，黄建平2，崔志浩2

Silk fibroin/hydroxyapatite combined with bone marrow mesenchymal stem cells for construction of tissue engineered cartilage

Yang Yao1, Xu Wei-yuan2, Zhang Ya3, Zhang Xing-xiang2, Liu Zong-bao2, Qian Hui2, Huang Jian-ping2, Cui Zhi-hao2 Abstract

BACKGROUND: With the emergence of tissue engineering, the possibility of repairing the cartilage injury is greatly increased, but single scaffold materials fail to meet ideal scaffold, and have some limitations. OBJECTIVE: To explore the feasibility of silk fibroin/hydroxyapatite combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) for construction of tissue engineered cartilage METHODS: BMSCs were isolated, cultured and induced into chondrocytes, which were cocultured with silk fibrion/hydroxyapatite to construct full-thickness articular cartilage defects in the platform of knee joints tibial plateau. A total of 45 rabbits with unilateral knee full thickness cartilage defects model were randomly divided into 3 groups. The compound group was implanted with cell-silk fibrion/hydroxyapatite compound; material group was only implanted with silk fibrion/hydroxyapatite; implantation was not given in the control group. The reparation condition of cartilage defects was observed by CT examination and histological examination at 8, 12 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: In the compound group, the articular surface was not flat, the joint space was increased, formed new chondrocyte-like cells and extracellular matrix was extremely rich after 8 weeks. In the material group, articular surface was collapsed and a small amount of chondrocytes were proliferated. After 12 weeks, in the compound group, the articular surface was flat, the joint space was normal; a large number of chondrocytes were emerged, and the color of repaired tissues was closed to surrounding cartilage and scaffolds were completely degraded. In the material group, the articular surface was not flat and cartilage cells did not completely filled, some scaffolds were degraded. The defects were not repaired in the control group. It is indicated that the method of repairing the full-thickness hyaline cartilage defects using BMSCs combined with silk fibroin/hydroxyapatite is feasible, and the silk fibroin/hydroxyapatite can be used as scaffold materials in articular cartilage tissue engineering due to a good biocompatibility. Yang Y, Xu WY, Zhang Y, Zhang XX, Liu ZB, Qian H, Huang JP, Cui ZH.Silk fibroin/hydroxyapatite combined with bone marrow mesenchymal stem cells for construction of tissue engineered cartilage. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(29): 5339-5342. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：随着组织工程的兴起，软骨损伤的修复可能性显著地提高，但单一的支架材料均不能符合理想支架，有一定的局限性。 目的：观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性。 方法：体外分离培养骨髓间充质干细胞，并定向诱导成软骨细胞，与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养，构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损。54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组，复合组植入细胞－丝素蛋白/羟基磷灰石复合物；材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石，对照组不行任何植入。植入后8，12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况。 结果与结论：植入后8周，复合组关节面不平整，关节间隙增大，形成新生类软骨细胞，基质丰富。材料组关节面塌陷，软骨细胞少量增殖。植入后12周，复合组关节面平整，关节间隙如常。大量软骨细胞出现，与周边软骨色泽一样，支架材料完全降解。材料组关节面不平整，软骨细胞不完全充填，支架材料部分降解。对照组未见修复。提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损，显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。 关键词：丝素蛋白/羟基磷灰石材料；骨髓间充质干细胞；细胞诱导；软骨缺损；软骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.29.005 杨耀，徐卫袁，张亚，张兴祥，刘宗宝，钱辉，黄建平，崔志浩.丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(29):5339-5342. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

减少摩擦，帮助膝关节进行光滑，无痛的活动。

0 引言

软骨一旦损伤，难以自愈，而各种软骨修

复方法疗效不一，各有优缺点

[1-2]

。随着组织工

膝关节软骨覆盖于股骨远端，胫骨近端及

程学的兴起，为解决这一问题提供了一条新途髌骨后方关节表面，由单一的软骨细胞，致密径。实验建立于此，探讨运用兔骨髓间充质干胶原与糖蛋白基质构成，无血管，淋巴管及神细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，经支配。主要功能是在关节间分散与传递负荷，

BMSCs)复合丝素蛋白/羟基磷灰石(silk fibroin/

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 万方数据1

School of Clinical Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China; 2

Department of Orthopaedics, First People’s Hospital of Zhangjiagang, Zhangjiagang 215600, Jiangsu Province, China; 3

Children's Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215003, Jiangsu Province, China

Yang Yao★, Studying for master’s degree, School of Clinical Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China yysun0102@ sina.com

Correspondence to: Xu Wei-yuan, Doctor, Professor, Chief physician, Department of

Orthopaedics, First People’s Hospital of Zhangjiagang, Zhangjiagang 215600, Jiangsu Province, China xwy143@163.com

Received: 2011-01-17 Accepted: 2011-03-18

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杨耀，等. 丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

1

江苏大学临床医学院，江苏省镇江市 212013；2张家港市第一人民医院骨科，江苏省张家3港市215600；苏州大学附属儿童医院，江苏省苏州市215003

杨耀★，男，1981年生，江苏省盐城市人，汉族，江苏大学在读硕士，主要从事脊柱外科和组织工程的研究。

yysun0102@ sina.com

通讯作者：徐卫袁，博士，教授，主任医师，张家港市第一人民医院骨科，江苏省张家港市 215600 xwy143@ 163.com

中图分类号:R318 文献标识码:B

文章编号:1673-8225 (2011)29-05339-04

收稿日期：2011-01-17 修回日期：2011-03-18 (20101117006/WL

•L)

5340

万方数据hydroxyapatite，SF/HA)材料修复关节软骨缺损的可能性。

１　　材料和方法　 设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010－03/10在苏州大学儿童医院骨科实验室完成。

材料：新西兰大白兔54只(BMSCs分离培养时另取1只同种新西兰大白兔)，雌雄不拘，体质量1.8~2.2 kg，由苏州大学实验中心提供，SF/HA由苏州大学李明忠教授提供。

主要试剂及仪器：　

试剂及仪器　

来源　 淋巴细胞分离液(percoll，

上海华美公司

密度为1.073 g/mL)

DMEM-F12

Gibco公司，美国

转化生长因子ß1，胰蛋白酶 Sigma公司，美国

小牛血清 杭州四季青公司 阿利辛蓝(Alcian Blue)

上海生工

离心机

Heraus，德国 超净工作台(21K-200型) 国营346厂 CO2孵育箱(NAPCO-5410) 美国

倒置显微镜

Olympus，日本

实验方法：　

BMSCs分离培养：自兔股骨大转子穿针抽取

骨髓(肝素抗凝)，平均5 mL。将肝素化骨髓与等量D-Hank’s液稀释，置于Percoll分离液上， 2 000 r/min，20 ℃下离心30 min，取分离液界面上的有核细胞，D-Hank’s液洗2次，弃上清，沉淀加入有DMEM培养液10 mL的50 mL培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为5%CO2饱和湿度静置培养，48 h后全量换液，此后两三天换液。细胞密度达到70%融合后用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养。

BMSCs诱导分化：取培养第3代细胞，用

2.5 g/L胰蛋白酶消化后调节细胞浓度为1× 107

L-1

，接种于6孔培养板，培养基为DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1 µg/L转化生长因子ß1+0.1 µmol/L地塞米松+50 mg/L抗坏血酸，常规培养14 d，每3 d全量换液1次。

诱导细胞阿利辛蓝染色：将爬满细胞的盖玻片

取出，在阿利辛蓝－0.1 mol/L盐酸溶液中染色 30 min，双蒸水冲洗3 min，0.5%中性红溶液染色3 min，双蒸水冲洗，无水乙醇脱色，二甲苯透明，封固，倒置显微镜下观察。

接种复合：第3代的BMSCs消化离心、取沉

淀，制成细胞混悬液，细胞计数后按3×109

L-1

浓度接种到材料上，培养箱内(37 ℃，体积分数

为5%CO2条件下)复合4 h。

模型制备：取新西兰大白兔，水合氯醛

10 mL/kg腹腔注射麻醉后仰卧固定四肢。取单侧膝关节内侧弧形切口，暴露胫骨平台负重区，用直径3 mm圆形钻头钻孔深3 mL，当钻透软骨下骨时略有阻力感，即停止钻入，可见新鲜血液溢出，制成关节全层软骨缺损模型。

分组：54只大白兔随机抽签法分为3组，每

组18只。复合组植入细胞－SF/HA材料复合物；材料组植入SF/HA材料，对照组不行任何植入。植入后肌注青霉素4×105

U/只，不活动，标准饲料单笼饲养。

主要观察指标：于植入后第8，12周各处死6只动物，取膝关节行CT检查、组织学观察。

２　　结果　

2.1 诱导细胞阿利辛蓝染色结果 细胞爬片经阿利辛蓝染色后细胞膜，细胞被染成蓝色，见图1，对照组均为阴性。 Figure 1 Induced cells were stained with Alcian

Blue (×100)

图1 诱导细胞阿利辛蓝染色(×100)

2.2 各组兔不同时间点CT平扫检查

复合组：　植入后8周，关节面稍不平整，软组织稍肿胀，关节间隙增大，见图2a。 植入后12周，关节面平整，内外侧关节间隙正常， 见图2b。 材料组：　植入后8周，关节面塌陷，部分骨面游离，见图3a。 植入后12周，关节面不平整，缺损处软组织影，见 图3b。 对照组：　植入后8，12周，关节面仍不光滑，见纵行裂隙，未见明显软骨组织，见图4。

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杨耀，等. 丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

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a: 8 wk b: 12 wk

Figure 2 Compound group was scanned by CT in sagittal at different time points after implantation 图2 植入后不同时间点复合组CT矢状位平扫

a: 8 wk b: 12 wk Figure 3 Material group was scanned by CT in sagittal at

different time points after implantation 图3 植入后不同时间点材料组CT矢状位平扫 a: 8 wk b: 12 wk Figure 4 Control group was scanned by CT in sagittal at dif-ferent time points after implantation

图4 植入后不同时间点对照组CT矢状位平扫

2.3 各组兔标本组织形态学检查　

复合组：　

植入后8周，修复组织由软骨样细胞构成，出现软骨陷窝结构，细胞数量多，排列不规则，细胞外基质较少，见图5a。 植入后12周修复组织表面平整，和周围软骨整合紧密、厚度相近，支架材料已完全降解吸收，见图5b。

材料组：　

植入后8周，材料表面大量炎性细胞包裹，出现幼稚软骨细胞，数量少，见图6a。

植入后12周，材料被纤维组织包裹，部分降解，软骨细胞与周边正常软骨组织结合不紧密，见图6b。

对照组：　

植入后8周，大量炎性细胞浸润，未见明显软骨细胞，见图7a。 植入后12周，缺损处有纤维组织充填，周边软骨部分退变，见图7b。

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万方数据 a: 8 wk b: 12 wk

Figure 5 Compound group was stained by

hematoxylin-eosin at different time points after implantation (×100)

图5 植入后不同时间点复合组苏木精－伊红染色(×100)

a: 8 wk b: 12 wk Figure 6 Material group was stained by hematoxylin-eosin

at different time points after implantation (×100) 图6 植入后不同时间点材料组苏木精－伊红染色(×100)

a: 8 wk b: 12 wk Figure 7 Control group was stained by hematoxylin-eosin at

different time points after implantation (×100)

图7 植入后不同时间点对照组苏木精－伊红染色(×100)

３　　讨论　

支架材料大致分为两种，即天然基质材料和人工合成材料。已有研究表明，这些材料除可作为生长因子或细胞载体外，部分材料还能刺激宿主细胞的生长及软骨基质的合成。Wambach等[3]

以Ⅰ型胶原为支架培养软骨细胞，细胞存活并表达其自身表型，产生细胞外基质。van Susante等[4]

在Ⅰ型胶原支架中加入硫酸盐软骨素促进细胞增殖分化。Willers等[5]

应用基质诱导自体软骨细胞移植技术，在Ⅰ型胶原膜支架上接种软骨细胞，并植入有3 mm软骨缺损的兔膝关节，结果细胞增殖分化形成健康软骨，12周时完全修复缺损。丝素蛋白作为人类最早利用的天然蛋白纤维，具有很多的优越性

[6-10]

，如良好的

组织相容性和良好的生物降解率等，越来越多被应用到

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组织工程研究当中。Altman等[11]

则直接将蚕丝纤维用于

人工师资韧带的制作，经过SEM，DNA定量等测试后，显示这样做成的支架能支持成人BMSCs的生长和扩散以及分化。苗宗宁等

[12]

用丝素蛋白支架材料复合BMSCs，

成功构建了膝关节软骨组织。单一的天然材料具备理想材料的一些特点，但仍有自身固有的缺点，它在临床的广泛应用，如机械强度差，不能承受生理应力。

同样也有一些研究着力于人工合成材料，因为可通过对它的微结构，机械性能预先设计和，达到理想的细胞载体作用。Uematsu等

[13]

在同种细胞移植中以

PLGA为支架，将间充质干细胞移植于有大片骨缺损的兔膝关节内，成功诱导出软骨组织。李旭升等

[14]

以快速成

形的PLGA三维支架接种骨髓基质细胞，可见细胞在支架上大量扩增，成功构建出软骨样细胞。但同样也有致命伤，降解率低下，部分会引起机体免疫排斥反应。

天然材料和人工合成材料各有优点，有利于细胞的吸附，增殖，分化，部分修复软骨组织，但都不是最理想的载体材料。基于此原因，本实验欲通过复合两种材料，发挥各自的优势，规避不足之处。丝素蛋白具有一定的韧性，可降解性，而羟基磷灰石良好的生物相容性

[15-17]

，软骨组织的传导性和诱导性，两者的结合可

以更好成为细胞的载体。通过取材观察，复合组膝关节软骨缺损修复平整，色泽较白，厚度均匀。CT影像检查关节面光滑，内外侧关节间隙正常。苏木精－伊红染色示大量软骨细胞充填，与周围软骨结合紧密，下层材料与周边组织融为一体，网孔中有大量类骨质，成熟骨小梁，相互连接成网状板层，软骨下骨修复完整。在各观察期内，成软骨细胞数量，修复程度明显优于材料组和对照组。分析此原因，丝素蛋白和羟基磷灰石两相间存在强烈键合作用，并呈现一定的长轴取向性，扩大了表面积，更好地为细胞黏附、代谢、营养物质的输送提供三维空间结构。据文献知，支架材料的孔径是一个至关重要的问题。张琴等

[18]

认为，随着NaCl添加量的增加，

SF/HA复合多孔材料的孔隙率，平均孔径，出现频率最大的孔径，孔径分布的离散型都增大。

综上所述，用BMSCs复合SF/HA成功构建组织工程化软骨，具有良好的组织相容性和降解率，为临床的实际应用打下了坚实的基础，拥有很好的前景。但两者之间的明确作用机制以及制备工艺仍需要进一步的研究。

4 参考文献

[1] Steadman JR, Briggs KK, Rodrigo JJ, et al. Outcomes of

microfracture for traumatic chondral defects of the knee: average 11-year follow-up. Arthroscopy. 2003;19(5):477-484. [2]

Gudas R, Stankevicius E, Monastyreckiene E, et al.

Osteochondral autologous transplantation versus microfracture for the treatment of articular cartilage defects in the knee joint in athletes. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2006;14(9): 834-842.

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万方数据

杨耀，等. 丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

[3] Wambach BA, Cheung H, Josephson GD. Cartilage tissue

engineering using thyroid chondrocytes on a type I collagen matrix. Laryngoscope. 2000;110(12):2008-2011.

[4]

van Susante JLC, Pieper J, Buma P, et al. Linkage of

chondroitin-sulfate to type I collagen scaffolds stimulates the bioactivity of seeded chondrocytes in vitro. Biomaterials. 2001; 22(17):2359-2369.

[5]

Willers C, Chen J, Wood D, et al. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 2005;11(7-8): 1065-1076.

[6] Meinel L, Fajardo R, Hofmann S, et al. Silk implants for the healing of critical size bone defects. Bone. 2005;37(5):688-698. [7]

Chiarini A, Petrini P, Bozzini S, et al. Silk

fibroin/poly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth: in vitro interactions with human cells. Biomaterials. 2003;24(5): 7-799.

[8] Petrini P, Parolari C, Tanzi MC. Silk fibroin-polyurethane scaffolds for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 2001;12(10-12): 849-853.

[9] Zhu ZH, Zhu LJ, Min SJ. Mokexue yu Jishu. 2002;22(3):48-51. 朱正华，朱良军，闵思佳.丝素蛋白膜的研究和应用进展[J].膜科学与技术，2002，22(3)：48-51.

[10] Kweon HY, Um IC, Park YH. Structural and thermal characteristics of Antheraea pernyi silk fibroin/chitosan blend film. Polymer. 2001;42:6651-6656.

[11] Altman GH, Horan RL, Lu HH, et al. Silk matrix for tissue

engineered anterior cruciate ligaments. Biomaterials. 2002;23(20): 4131-4141.

[12]

Miao ZN, Pan YH, Zhu JZ, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2008;12(27):5243-5245.

苗宗宁，潘宇红，祝建中，等.丝素蛋白支架材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨[J].2008，12(27)：5243-5245.

[13]

Uematsu K, Hattori K, Ishimoto Y, et al. Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a three-dimensional

poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold. Biomaterials. 2005; 26(20): 4273-4279.

[14]

Li XS, Hu YY, Fan HB, et al. Disi Junyi Daxue Xuebao. 2005; 26(11): 978-982.

李旭升，胡蕴玉，范红彬，等.组织工程骨软骨复合物修复兔关节骨软骨缺损及其相关研究[J].第四军医大学学报，2005，26(11)：978-982.

[15] Tian CX. Taoci Xuebao. 2003;24(1):20-24.

田从学.羟基磷灰石的实验合成研究[J].陶瓷学报，2003，24(1)：20-24.

[16]

Li DM, Zhang SZ, Chen T, et al. Zhonghua Zhengxing Waike Zazhi. 2004;20(3):180-183.

李冬梅，张盛忠，陈涛，等.羟基磷灰石/超高分子聚乙烯复合材料的组织相容性及骨传导性实验室研究[J].中华整形外科杂志，2004，20(3)：180-183.

[17] Miki T, Masaka K, Imai Y, et al. Experience with freeze-dried PGLA/HA/rhBMP-2 as a bone graft substitute. J Craniomaxillofac Surg. 2000;28(5):294-299.

[18]

Zhang Q, Luo ML, Li MZ, et al. Suzhou Daxue Xuebao: Gongkeban. 2009;29(4):1-4.

张琴，罗淼良，李明忠，等.NaCI 添加量对SF/HA 复合多孔材料结构和性能的影响[J].苏州大学学报：工科版，2009，29(4)：1-4.

来自本文课题的更多信息－－　　 作者贡献：第一作者进行实验设计及实验实施，实验评 估为第二、三作者，资料收集为第一作者，第一作者成文，第 二作者审校，第一、二作者对文章负责。 致谢：衷心感谢苏州大学儿童医院骨科实验室及苏州市 中医院病理科各位老师在实验实施过程中的大力帮助。 利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济 组织直接或间接的经济或利益的赞助。 伦理批准：实验过程中对动物的处置符合中华人民共和 国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意 见》标准。 本文创新性：检索2009－03/2010－03万方数据库，检索 骨髓间充质干细胞，支架材料，软骨细胞，损伤修复等关键词， 发现实验创新之处在于复合支架材料的选取，为软骨细胞依 附，生长繁殖提供可行性载体。

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