生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200910114186.2[51]Int.CI.

C12P 19/18 (2006.01)C12P 19/12 (2006.01)C12R 1/865 (2006.01)

[43]公开日2009年12月2日[22]申请日2009.06.30[21]申请号200910114186.2

[71]申请人广西投资集团维科特生物技术有限

公司

地址530105广西壮族自治区南宁市武鸣县里建

武华大道156号[72]发明人(请求不公开姓名)

[11]公开号CN 1015916A

权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页

[54]发明名称

生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法[57]摘要

生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，其工艺过程包括：(1)将蔗糖溶液和具有α－葡萄糖基转移酶的固定化细胞在转化罐内充分转化，制得含有异麦芽酮糖和其他杂糖的转化液，转化液中的异麦芽酮糖含量达到85％以上；(2)将所制得的转化液通入装有固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的去杂糖反应罐，以去除转化液中异麦芽酮糖以外的绝大部份杂糖；(3)再将去除杂糖后的转化液经过脱色压滤、离子交换、浓缩、高温真空结晶、离心除去残余的杂糖及其它杂质，获得异麦芽酮糖的结晶体。

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权 利 要 求 书

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1、生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，包括先将蔗糖溶液用α-葡萄糖基转移酶转化而成的异麦芽酮糖及杂糖，然后去除转化液中的杂糖，其特征在于：工艺过程如下： (1)以蔗糖溶液为原料，使蔗糖溶液和具有α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞在转化罐转化，反应温度为26～32℃，制得含有85％以上的异麦芽酮糖及其他杂糖的转化液； (2)将所制得的转化液再通入装有固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的反应罐，利用酿酒酵母的作用去除转化液中大部份的残余蔗糖、葡萄糖、果糖等杂糖，反应温度为26～32℃；

(3)将制得的转化液经过脱色过滤和离子交换净化工序，再经浓缩、高温真空结晶、离心分离去除残余的杂糖及其它杂质，获得异麦芽酮糖的结晶体。

2、根据权利要求1所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于：所述的在转化罐内转化是指固定化细胞在反应罐内和蔗糖溶液充分混合，固定化细胞悬浮在蔗糖溶液中，同时施加包括机械搅拌，压缩空气翻动，泵循环等搅拌作用，使固定化细胞和蔗糖溶液充分接触，加快转化速度，直至转化液中的异麦芽酮糖含量达到85％以上。

3、根据权利要求1所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于：所述的固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是在酵母溶液中加入海藻酸钠，使混合物中海藻酸钠的质量浓度为7～12％、湿酵母占10～30％，混合均匀后，将其成型后放入质量百分比为1.0～5.0％的氯化钙溶液中保持1～2小时，洗净而成；

所述的固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其培养采用以下制备工艺： a.培养基以质量含量计：1-3％酵母浸膏，2-6％蔗糖，0.05～0.1％消泡剂，pH4～7，120～125℃灭菌25～30min，冷却至32.5～35.5℃，按2～10％的接种量接入酵母菌种，按发酵体积，每分钟通入0.3～10％的通气量，搅拌转速为100～200rpm，培养1-3天，放罐； b.发酵液经10000～16000rpm的管式离心机或膜过滤收集得湿酵母。 4、根据权利要求1所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于：所述的高温真空结晶是在结晶罐中加入浓度为60-85％Bx的异麦芽酮糖液，在-0.06至-0.09MPa，50℃-90℃，加入体积含量W/V 0-30％的晶种，15-30小时内使异麦芽酮糖结晶。

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说 明 书

生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法

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技术领域

本发明涉及一种以生物酶制备异麦芽酮糖的生产方法，特别是以蔗糖溶液为原料制备异麦芽酮糖的方法。背景技术

异麦芽酮糖(Isomaltulose)是一种还原性双糖，1957年，由Weidenhagen等人在甜菜制作中首先发现。异麦芽酮糖具有与蔗糖类似的甜味特性，其甜味是蔗糖的一半左右，无任何异味。与蔗糖相比，异麦芽酮糖的突出优点体现在：(1)低致龋齿特性；(2)适合糖尿病人食用。作为一种有前途的功能性甜味剂，异麦芽酮糖已在日本、美国、西欧等国家得以广泛应用，应用范围包括硬糖、软糖、口香糖、巧克力、焙烤食品、水果罐头、果酱、运动饮料和牙膏等。

另外异麦芽酮糖也是异麦芽酮糖醇(Isomalt)的原料，异麦芽酮糖醇是异麦芽酮糖经氢化反应得到，异麦芽酮糖醇又称氢化异麦芽酮糖、帕拉全糖醇，性状：白色无臭结晶，味甜，甜度约为蔗糖的45％-65％，稍吸湿，熔点145-150℃，比旋光度≥+91.5°(4％水溶液，M/V)；溶于水，其在水中的溶解度室温时低于蔗糖，升温后可接近蔗糖，不溶于乙醇。根据我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-1996)规定(09年已成为新资源食品)：异麦芽酮糖醇，可在雪糕、冰棍、糖果、糕点、果汁(味)型饮料、饼干、面包、果酱、配制酒中按生产需要适量使用，也可应用于焙烤食品。

异麦芽酮糖醇是近年来国际上新兴的一种功能性糖醇，是蔗糖、淀粉糖及其它糖醇的优良替代品，具有低吸湿性、高稳定性、高耐受性、低热量、甜味纯正等特点。产品安全性极高，美国FDA给予其GRAS(公认安全)地位，对其每日摄入量不作。从营养学的角度来讲异麦芽酮糖醇是一种碳水化合物，而从生理上的角度来讲，它在人体内不易被分解吸收，也不为绝大多数微生物分解利用。产品作为糖的替代品，广泛应用于无糖食品、无糖保健品和无糖药品等产品的生产上。异麦芽酮糖醇具有以下特性：①适合糖尿病病人食用，不会引起血糖和胰岛素上升。②非致龋齿性，口腔内的变形链球菌不能分解利用，不产生酸和葡聚糖，不会造成蛀牙，特别适合儿童食用。③低热量，适合高血压、高血脂、肥胖及害怕肥胖

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的人群食用。④高耐受性，很多甜味剂，如山梨醇、木糖醇、氢化葡萄糖浆、麦芽糖醇浆及很多低聚糖，如食用过多会造成腹胀、肠鸣、腹泻等不适现象，因而FAO/WHO都规定其最大使用量，但人体对异麦芽酮糖醇的耐受量却惊奇的大，每日摄入50g不会造成肠胃不适，因此经FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会审查通过，对异麦芽酮糖醇的每日摄入量可不作规定。⑤较合理的负溶解热，异麦芽酮糖醇负溶解热只有39.4KJ/kg，因此不会在品尝中出现不适的冰凉口感。⑥甜味纯正天然，可与其它强力甜味剂(如甜蜜素、甜菊糖)配合使用，掩盖其它强力甜味剂的不良味道。⑦高稳定性，异麦芽酮糖醇为多元糖醇，没有还原性，非常稳定，在较强的酸、碱条件下也不水解，在很高温度下也不产生色素，与蔗糖相比，其稳定性在数值上大10倍以上；也不会和食品中其他成份发生化学反应，如与氨基酸发生美拉德反应。异麦芽酮糖醇不能被绝大多数微生物利用，因此，使用异麦芽酮糖醇生产的产品具有更长的货架期。⑧非吸湿性，与蔗糖、葡萄糖或某些低聚糖相比异麦芽酮糖醇具有非常低的吸湿性。在25℃相对湿度为70％时，基本没有吸湿，便于包装和运输。⑨异麦芽酮糖醇是一种优良的双歧杆菌增殖因子，虽然异麦芽酮糖醇不能被人体和绝大多数微生物的酶系所利用，但却可以被人体肠道中的双歧杆菌所分解利用，促进双歧杆菌的生长繁殖，维持肠道的微生态平衡，有利于人体的健康，可作为生产适于糖尿病患者食用、怕肥胖人群或低热量类型巧克力的理想原料。异麦芽酮糖醇是一种优良的蔗糖替代品，其独特的理化性质、生理功能和食用安全性已经实验充分证实，其用量近年来急剧上升，在欧美等发达国家，已占据无糖食品所使用甜味剂50％以上市场。

中国专利文献报道了一种异麦芽酮糖的制备方法，专利申请号：00109673.7，公开(公告)号：CN1330149A，申请(专利权)人：范志刚，其工艺过程为：(1)以蔗糖溶液为原料，使蔗糖溶液通过固定化的α-葡糖基转移酶反应柱或罐，制得含有由酶转化而成的异麦芽酮糖和其他杂糖的转化液；(2)将所制得的转化液通入其中装有固定化酵母的去杂糖反应罐，以去除转化液中异麦芽酮糖以外的杂糖；(3)再将去杂糖后的转化液离心去残渣后得到含异麦芽酮糖的清液，再将该清液催化加氢制成异麦芽酮糖醇。本发明将第一步所得的转化液通过固定化酵母去掉杂糖，使转化液中的异麦芽酮糖含量提高，再将这种转化液催化加氢生成异麦芽酮糖醇，大大提高了蔗糖原料的利用率；此外，新方法还可大幅度节约能源，提高生产效率。该文献所使用的固定化酵母采用啤酒酵母、葡萄汁酵母、异常汉逊酵母、铁红梅契酵母、红冬抱酵母或粘红酵母中的一种或多种混合在载体上固定化而成。

中国专利申请号：200710190755.2名称：一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用公开(公告)号：CN101200750申请(专利权)人：南京工业大学，该发明公开一种大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)NX-5及利用该菌生产蔗糖异构酶进而制备异麦芽酮糖的方

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法。将该菌株CGMCC No.2222接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好气培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。采用该菌株使蔗糖转化率高达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率达90％，转化液中异麦芽酮糖浓度达500g/L，无水解副反应，转化液中几乎不含葡萄糖和果糖，随着反应进行也不会使产物异麦芽酮糖转化为其他成分，对工业化生产异麦芽酮糖十分有益。

中国专利申请号：200510050911.6名称：制备结晶异麦芽酮糖和氢化异麦芽酮糖的方法公开(公告)号：CN1680575申请(专利权)人：株式会社上野制药应用研究所，地址：日本大阪府发明(设计)人：本多纯哉；古川阳二郎；栗山义显；上野贵生，摘要：提供了一种由蔗糖生产结晶异麦芽酮糖的方法，包括以下步骤：1)在α-葡糖基转移酶有活性的条件下使α-葡糖基转移酶与蔗糖水溶液或浆液接触；其中在反应混合物中异麦芽酮糖浓度达到晶体形成的点之后仍然保持所述条件，和2)将反应混合物分离成为结晶异麦芽酮糖和剩余糖浆。根据本发明，蔗糖的酶转化和异麦芽酮糖的结晶在同一反应容器中同时进行。另外，酶可以重复使用。

中国专利申请号：200510035439.9名称：一种异麦芽酮糖醇的制备方法公开(公告)号：CN1884561申请(专利权)人：万代生物技术(深圳)有限公司，摘要：一种异麦芽酮糖醇的制备方法，其工艺过程为：(1)以蔗糖溶液为原料，使蔗糖溶液通过固定化的α-葡糖基转移酶反应柱或罐，制得含有由酶转化而成的异麦芽酮糖和其他杂糖的转化液；(2)将所制得的转化液通入其中装有固定化酵母的去杂糖反应罐，以去除转化液中异麦芽酮糖以外的杂糖；(3)再将去杂糖后的转化液离心去残渣后得到含异麦芽酮糖的清液，再将该清液催化加氢制成异麦芽酮糖醇。本发明将第一步所得的转化液通过固定化酵母去掉杂糖，使转化液中的异麦芽酮糖含量提高到98％以上，再将这种转化液催化加氢生成异麦芽酮糖醇，大大提高了蔗糖原料的利用率；此外，新方法还可大幅度节约能源，提高生产效率。 中国专利申请号：00819035.6申请日：2000.02.15名称：克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合酶基因公开(公告)号：CN1434861，申请(专利权)人：分子农业生物学院，地址：新加坡新加坡发明(设计)人：张炼辉；李宪臻；张道海，国际申请：PCT/SG00/000232000.2.15，摘要：本发明涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3及LX21。本发明还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的酶的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。本发明还涉及用于分离编码KIS蛋白的核苷酸序列的功能克隆方法，包括步骤(a)从供

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体生物备基因库，其含有编码在适当的宿主生物体中的异麦芽酮糖生物合成活性的DNA序列；(b)利用它们的增加的还原糖含量从基因库中筛选目的克隆；(c)分离含有编码具有异麦芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。

上述文献存在的不足之处是：1、在工业化生产过程中用膜技术收集菌体的设备庞大价格昂贵，生产成本高；2收集到的菌体浓度低，即含有大量的转化液，降低了生产效率；3、物料在转化柱内的流速很慢停留时间长容易出现结晶堵塞。4、物料在转化柱内的流动不可能达到理想的层流状态往往出现偏流短路情况，导致物料和菌体接触不充分，转化效率低.发明内容

本发明的目的是提供一种能提高蔗糖原料利用率，产品质量更高，更具有工业化生产价值的制备异麦芽酮糖的新方法。

发明提出的生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，其工艺过程如下： 1、以蔗糖溶液为原料，使蔗糖溶液和具有α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞在反应罐内经15至60小时充分搅拌混合，反应温度为26～32℃，得到含有85％以上的异麦芽酮糖及其他杂糖(如蔗糖、葡萄糖、果糖等)的转化液；所述的α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞与现有技术相同。

2、将所制得的转化液再和具有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的固定化细胞放入反应罐经10至30小时充分搅拌混合，反应温度为26～32℃，利用酿酒酵母的作用去除转化液中大部份的蔗糖、葡萄糖、果糖等杂糖；

3、将制得的转化液经过脱色过滤、离子交换净化工序，再经浓缩、高温真空结晶、离心分离去除残余的杂糖及其它杂质，获得异麦芽酮糖的结晶体。

所述的固定化酿酒酵母是在酵母溶液中加入海藻酸钠，使混合物中海藻酸钠的质量浓度为7～12％、湿酵母占10～30％，混合均匀后，将其成型后加入质量百分比为1.0～5.0％的氯化钙溶液中浸泡1～2小时，洗净而成。

所述的充分搅拌混合是把固定化细胞和蔗糖溶液放入反应罐内然后施加包括机械搅拌，压缩空气翻动，泵循环等搅拌作用，使固定化细胞和蔗糖溶液充分接触，加快转化速度。 所述的固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的培养可采用以下具备工艺： a.培养基(以质量含量计)：1-3％酵母浸膏，2-6％蔗糖，0.05～0.1％消泡剂，pH4～7，120～125℃灭菌25～30min。冷却至32.5～35.5℃，按2～10％的接种量接入酵母菌种，并以0.3～10％(每分钟通入的空气量：发酵体积)的通气量、搅拌转速为100～200rpm培养1-3天，放罐。

b.发酵液经10000～16000rpm的管式离心机或膜过滤收集得湿酵母。

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所述的高温真空结晶，是在结晶罐内中加入浓度为60-85％Bx的异麦芽酮糖液，在-0.06至-0.09MPa，50℃-90℃，加入0-30％(W/V)晶种，15-30小时内使异麦芽酮糖结晶。 本发明的优点：

1、在本发明异麦芽酮糖的制备新方法中，由于具有将蔗糖溶液和固定化细胞充分混合接触的工艺过程，使转化速度更快，效率更高，转化液中的杂塘(包括残余蔗糖、葡萄糖、果糖等)通过固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分解作用，可使转化液中的异麦芽酮糖含量达到90％以上，大大提高了转化液结晶成异麦芽酮糖的纯度。

2、采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的固定化细胞反应罐，能够去除转化液中的大部份杂糖，比对比文献报道的采用啤酒醉母、葡萄汁酵母、异常汉逊酵母、铁红梅契酵母、红冬抱酵母或粘红酵母中的一种或多种混合去除杂糖效率更高以及反应条件更容易控制。

3、采用高温真空结晶法结晶，在结晶罐内不容易形成结块物料，能耗更低，结晶效率更高，物料也不容易染菌，产品质量更好，异麦芽酮糖纯度达到99％以上。附图说明

图1是本发明的异麦芽酮糖的制备工艺流程图。

如图1所示，首先将蔗糖溶液用循环泵10通过装有具有α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞反应罐1中转化，反应制得含有85％以上的由酶转化而成的异麦芽酮糖及1其他杂糖的转化液；反应罐1下部有过滤网，将固形物分离，循环泵10出口有三通阀2，一边通到具有α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞反应罐的顶部，另一边通到装有固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的去杂糖反应罐3的入口，去杂糖反应罐3下部有过滤网，循环泵11出口有三通阀4，一边通到去杂糖反应罐3的顶部，另一边通到脱色过滤5进口，经过循环泵12到离子交换树脂柱6浓缩7高温真空结晶8和离心分离9，得到异麦芽酮糖产品。 具体实施方式

实施例一制备异麦芽酮糖的工艺过程：

(1)将蔗糖溶液循环通过装有具有α-葡萄糖基转移酶的固定化细胞的转化罐中转化，反应温度26～32℃，反应制得含有85％以上的异麦芽酮糖及其他杂糖(如蔗糖、葡萄糖、果糖等)的转化液；

(2)将所得的转化液循环通入装有固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的去杂糖反应罐，在28-32℃条件下通气转化24-36小时，至无气泡产生时表明杂糖已消耗完毕，

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得到去杂糖的转化液；

(3)将去杂糖后的转化液经过离子交换去杂质后得到含异麦芽酮糖的清液，该清液含有

异麦芽酮糖可达90％以上。

(3)将异麦芽酮糖的清液经过浓缩、高温真空结晶、离心去除其中的杂糖及其它杂质，

获得异麦芽酮糖的结晶体。高温真空结晶，是在结晶罐内中加入浓度为6085％Bx的异麦芽酮

糖液，在-0.06至-0.09MPa，50℃-90℃，加入0-30％(W/V)晶种，15-30小时内使异麦芽酮

糖结晶。

实施例二制备固定化酿酒酵母的工艺过程：

固定化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养可采用以下具备工艺：a.培养

基(质量％)：1-3％酵母浸膏，2-6％蔗糖，0.05～0.1％消泡剂(花生油或聚硅油类)，pH4～

7，120～125℃灭，菌25～30min。冷却至32.5～35.5℃，按2～10％的接种量接入酵母菌种，

并以0.3～10％(每分钟通入的空气量：发酵体积)的通气量、搅拌转速为100～200rpm培

养48±12h，放罐；b.发酵液经16000rpm的管式离心机离心收集得湿酵母；c.将湿酵母用

无菌水溶解、过滤，加入7～12％预先溶解好的海藻酸钠溶液中，并使湿酵母在该溶液中的浓

度为10～20％，混合均匀；d.将以上的酵母乳液和海藻酸钠混合液成型后放入1～5％CaCl2

溶液中进行固定化，浸泡约半小时后，取出固定化颗粒用自来水洗干净，投入去杂糖反应罐

中即可使用。

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说 明 书 附 图

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图1

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