水产动物遗传育种学教案(精)

水产动物遗传育种学

教 案

课程名称：水产动物遗传育种学 授课教师：洪一江，彭扣

所在单位：生命科学与食品工程学院

绪 论

一、水产动物育种学研究的对象 （一）水产动物的范畴

水产动物是对人类生产和生活具有经济价值的水生动物.种类十分广泛,有多种无脊椎动物和脊椎动物.如轮虫、甲壳类、鱼类及水生哺乳类等。 （二）水产动物的繁殖特征 １、群体大小 ２、生殖方式

（１）水产动物的生殖策略几乎包含了动物界已知的各种形式，根据其生殖细胞的有无及作用氛围以下两种：有性生殖、无性生殖；

（２）生殖方式：根据生殖中胚胎发育的场所和营养来源，水产动物的生殖方式可以分为：卵生、卵胎生、胎生。 ３、遗传特点及育种的关系

由于异质性的存在，大群体的各种生长性能具有杂和体的典型特征，一旦群体变小，异质性降低，群体就会表现出来某种程度的遗传衰退和生长速度降低，在生产中这种现象成为衰退或退化。在水产动物的育种过程中，要充分考虑异质性的特点，采用适合这种群体的育种方法才能提高育种效率。 （三）水产动物育种的对象

养殖对象种类繁多，是水产动物育种区别于畜、禽育种的显著特点。 育种对象的选择要考虑以下几点：

首先，应该考虑土著种类而且时常上对新品种需求比较迫切的重要水产动物作为主要育种对象。

其次，有些种类虽非土著种类，但因如时间较长，有一定的资源基础，在生产和消费上都有较大的比重，经过努力可以解决国内时常需求，培育出适合时常需求的新品种。

合适的与措施对于所有水产动物都是必需的，但不同育种对象的育种任务往往

也有过不同： （１）池塘和网箱养殖对象育种的主要任务在于提高品种的生产性能； （２）海洋牧场几海水工厂化养殖的养殖对象育种的首要任务是使水产动物适应于海水养殖的特殊条件，特别是在活动的条件下，要求适应于高密度和有效地利用天然饵料资源几人工配合饲料；

（３）水产观赏动物育种的目的是培育出体色鲜艳及体形变异的新品种，培育出具有特殊形态的观赏水产动物家系；

（４）水产实验动物育种的目的是培育用语现代科学研究，在遗传上具有同质性、对各种实验反应具有一致性的水产动物

（５）野生淡水和回游性水产动物的任务也有其具体要求

二、水产动物育种学的任务和方法

（一）水产动物育种学的任务与内容

水产动物育种：指应用各种遗传学方法，改造水产动物的遗传结构，培育出适合人类养殖生产活动需要的品种的过程。

其根本任务是：在研究和掌握水产动物形状遗传变异规律的基础上，根据各地区的育种目标和原有品种的基础，发掘、研究和利用各种动物资源，采用适当的育种途径和方法，选育出适宜于该地区生态环境、生产条件，符合生产发展需要的高产、优质、抗逆和适应性广的优良品种，或者创造出新的动物；并通过行之有效的繁育措施，在反之、遗传性能的维护和推广过程中保持和提高品种的特性，促进水产养殖业的发展。

水产动物育种学的内容

野生种类驯化，优良物种引进，水产动物品质改良，繁育群体生产性能保护，杂种优势利用以及优良新品种培育的理论和实践

（二）育种方法

选择育种实践中最基础，最原始，最常用的方法。分为人工选择和自然

选择；

引种和驯化育种工作中非常重要的手段；

生物技术常用的生物技术有：单倍体育种，多倍体诱导，细胞核移植，

转基因技术，分子标记等。

三、水产动物的育种目标

育种目标：是对育种工作所需要解决的主要问题的定性或定量的描述，也是

所要培育的新品种在一定自然、生产、经济及技术条件下养殖时，应具备的一系列优良形状的指标，是育种方案的基本内容之一。

（一）水产动物育种的主要目标性状

、生长特性和饲料转化率 、繁殖特性 、抗病能力 、适应特性 、体色与体形

6、产品品质

（二）制订育种目标的主要根据和原则

1、制订育种目标的 主要根据：客观需要、主观条件、最佳效益和竞争优势； 2、制订育种目标的主要原则

需要与可能，当前与长远，目标性状和非目标性状，育种目标和组成性状的具体指标。

四、品种与杂交的吧、概念及特点 （一）品种的概念

1、品种与品系 种是生物学分类单位；

品种是人类根据滋生需要创造出的一种生产资料 ，一般是指经多代人工选择育成的，具有遗传稳定，并有别于原种或同种内其他群体模具有有两经济性状及其他表形性状的水声动物群体。它是人类生产活动的产物，其产生是养殖业发展到一定阶段后的必然产物。

品系是指来源于一个亲本对（或共同祖先）形成的群体，它具有突出的特点和性状，相对稳定的遗传性和一定数量的个体 。

一个品系的性状必须独特但不一定符合生产需求；育种过程种首先得到若干个性状独特的品系，具备优良性状的品系经过鉴定，即可作为品种推广使用。

几个概念：

家系：一般是指由一对系祖繁育而来的群体。

近亲交配系（自交系）：在品种的发展过程中，随着动物群体的不断扩大，分布区域 也会逐步扩大由于各地的自然田间不同，饲养管理水平和方式的区别，在品种内会出现差异。具有这样差异的类群可以称为地方品系。 单系：由一个系祖发展而来的群体。 群系：一个品系的系祖是一个群体。

种群：水产动物中种群的概念类似于家畜育种的单系或群系，是指同一五种在某一特定时间内占据某一特定空间的一群个体所组成的群集。 2、品种应具备的条件

凡能称为品种的水产动物，除具有较高的经济价值以外，还应具有一下特征： （1）性状及适应性相似； （2）稳定遗传； （3）生产性能； （4）数量。 （二）品种的分类

根据养殖对象遗传基础的不同，养殖的对象可以分为：

育成品种——品种种有许多人工雕刻的合计，是人类有意识选择的结果，因

此又称为育成品种。

自然品种——指未经任何人工选择或育种活动，经过简单的驯化过程或不经

过驯化直接为人类的养殖活动所利用的自然种。

原种——指取自模式种采集水域或取自其他天然水域并用于养（增）殖生产

的野生水产生物五种以及用于选育种的原始亲本。

⏹ 杂交种——指不同品系、不同品种甚至中间个体交配得到的具有一定生产性能的群体。

另外，在鱼类中还有多倍体品种及其他类型的养殖群体 （三）杂交种

杂交种指不同品系、不同品种甚至中间个体交配得到的具有一定生产性能的群体。它是经过杂交试验选择出的配对组合，其杂种一代具有生长优势或其他方面的优势。 （四）品种的审定

全国水产原、良审定委员会是主观全国水产原种、良种（包括品种、杂交种和引进种）审定的权威机构。

经过试验需要推广的品种有全国水产原、良种审定委员会审核发布中华人民共和国农业部公告。公告种品种命名登记好说明：G为“国”的第一个拼音字母，以示国家级品种；S为“审”的第一个拼音字母，以示审定通过的品种；为了命名上的方便，将品种、引进种统称为品种，01、02、03分别表示品种和引进品种程序好；001、002为品种顺序号；年代为审定通过的时间。如GS01001-2000为团头鲂浦江1号的命名登记号。 五、水产动物育种的成就与展望 （一）育种学基础与生物技术研究 （二）鱼类品种培育 （三）鱼类的引种工作 （四）存在的问题及展望

1、引种的成就；2、品种选育；3、育种理论；

4、生物技术；5、繁育群体的保护

第一章 水产动物种质资源

第一节 种质资源的概念、重要性和类型

（一）种质资源的概念

1、种质：由德国生物学家魏斯曼12在建立其“种质学说”过程提出的概念，即决定遗传性状，并将遗传信息传递给后代的遗传物质（或遗传材料）。 2、资源：是指资财的来源，是对人类具有实际或潜在利用价值的材料，是在一定的技术经济条件下，现实或可预见的将来能作为人类声场和生活所需要的一切物质和给物质的要素。

3、种质资源：又称遗传资源，在我国习惯称为品种资源。《生物多样性公约》中将其定义为对人类具有实际或潜在用途或价值的遗传材料。

4、水产动物种质资源：是指对水产养殖和水产动物的遗传改良有实际或潜在利用价值的遗传材料，包括水产动物的家养种（品种、品系）和野生种（变种。）

（二）研究种质资源的重要性

现代的育种成就，从根本上来说决定于对种植资源的认识和利用，如果育种工作者掌握的种质资源越丰富，对它们的研究越深透，则利用它们选育成新品种的可能性也就越大。

国际遗传育种学界流行的一句话是：“谁掌握种质，谁就掌握未来”。 （三）种质资源的类型

第二节 水产动物种质资源研究概况

（一）种质资源问题的提出

自1980年1月在瑞典斯德哥尔摩召开了天然鱼类种质资源保护——鱼类基因库的国际学术会议之后，有关鱼类种质资源问题已正式提出。 （二）水产动物种质资源的特殊性

水生动物和陆生动物在种质资源的研究和保护上存在各方面的差异： （1）国家所有权不明确；

（2）环境更具连续性； （3）观察、研究更难； （4）亲昵感较低；

（5）生物多样性的量更高； （6）表型的变异性较大； （7）释放时间较多，影响较大； （8）杂交能力较强；

（9）野生群体的重要性更突出； （10）人工控制繁殖应用较少； （11）重视程度较低。 （三）研究概况

我国水产动物种质资源方面研究相对较早，自20世纪50年代以来做了大量工作。

（四）水产动物种质资源研究的主要方向

查明海洋和内陆水域渔业资源的种类组成、分布、数量及变化规律，制定科

学合理的水生动物种质资源保护和持续利用的中长期规划；

对我国水产动物和新近开打的野生养殖种类及引进品种开展综合研究，建立

种质资档案，掌握基因知识产权；

建立功能齐全、数据相似，功能强大的数据库，建立便捷使用的网络，以达

到资源共享；

研究精、卵和胚胎的低温保存技术，建立水生动物种质资源胚胎库、细胞库

和基因库；

研究濒危五种繁殖和养殖技术，建立人工养殖群体，进行大规格鱼种的标志

放流；

研究和选择野生水生动物种质资源中有价值的种类，进而开发利用；

研究恢复和重建水生动物栖息地的途径和方法，修复水域生态环境，进行科

学合理的资源增殖放流，恢复衰退中的种质资源，保持水体中水生动物种质资源的多样性，以利于水生动物种质资源持续利用。 第三节 水产动物种质资源的多样性

一、物种多样性

物种：指个体间可以自由交配和生殖繁衍（或潜在地具有这种能力）的一组自然种群，通过某种隔离机制，使得它们在遗传上同其他类似的一组种群相互隔离着。从种质资源角度来看，物种就是拥有自然闭锁机制的相对的基因

库。

基因库：是指一个物种所含有的总的遗传信息。

物种多样性，实质上是关于生物物种的生物学多样性，物种数量是物种多样性

最直接也是最终的度量指标。

（一）中国特有物种

目前，已调查并记录的我国水生生物达20200余种，其中鱼类3862种，占世界

鱼类物种数量的20%左右。 受独特的气候、地理及地质历史等因素的萦系那个，我国水生生物具有特有程度高，孑遗物种数量达、生态系统类型齐全等特点，在世界生物多样性种占有重要地位，其中有许多是特有物种。中国特有鱼类有440余种，如青、草、鲢、鳙等，占已知种数14.6%；特有两栖动物30余种，占已知种数的10.8%；

特有爬行动物26种，占已知种数的6.9%。

（二）经济物种

在我国内陆水域鱼类资源种，主要经济鱼类约有140种。

我国为养殖目的引入我国的鱼类有30多种，如罗非鱼，白鲫和白鳟等。 中国经济甲壳动物主要种类有中华绒螯蟹，日本沼虾，秀丽白虾，克氏原螯虾

等； 现今世界上龟鳖目动物约有240种，我国正式记载的有31种，其中乌龟、山瑞

鳖和中华鳖是主要养殖对象；

扬子鳄、大鲵是我国重点保护的爬行类水产动物。

（三）濒危物种

国际自然保护联盟（IUCN）根据各种指标，将物种受环境胁迫的程度分为灭

绝、自然灭绝、受危和低危4级。

具体如下图所示： 濒危的判断依据：

第一，群体数量减少，在过去10年或3 个世代的时间内减少了50%以上，估计

在今后10年或3 个世代的时间内将继续减少50%以上； 第二，分布区严重分割，或已知栖息点不到5个，栖居范围不断减少，栖居范围波动剧烈，出现范围不到5000km2，或估计世纪栖居范围不到500km2； 第三，估算性成熟个体不到2500个；

第四，估计在今后20年或5个世代时间里，在自然界灭绝的概率至少为20%。 目前，列入《中国濒危动物红皮书》的濒危鱼类物种数量92种，包括仅分布于的4个物种和的林氏细鲫，占全国淡水鱼类的11.7%，其中中国特有鱼类60种。

濒危两栖类有3目8科13属31种，占全国已知两栖动物总数的10.6%，其中包括17种我国特有两栖动物

濒危爬行动物有20科54属96种，占全国已知爬行动物总数的24.3%，其中30种为中国特有。 二、遗传多样性

遗传多样性也称基因多样性，是生物多样性三大层次之一，也是种质资源多样性的核心。广义的遗传多样性指种内或种间表现在分子，细胞，个体三个水平的遗传变异度。下一的遗传多样性指种内不同群体和个体间的遗传变异度。 （一）多样性和杂合性

多样性表现在从形态特征到DNA的核苷酸及它们所编码的酶与蛋白质的氨基酸序列。一个基因或一个表型特征若在群体内有多于一种的形式，它就是多态的基因或多态的表型。为了量化描述遗传变异，以群体种多态基因的比例来表示多样性的大小。

例如：用电泳法观测了虹鳟的30个基因座，其中12个基因座上为发现变异，其余18个基因座上检出了变异，可以计算有18/30=0.60基因座在群体中是多态的 ，或者说群体多态性程度是60%。

杂合性（度）是遗传变异的另一个量度，是指基因座上是杂合的个体的平均频率，或称为群体的平均杂合性。其计算公式为： H=每个基因座为杂合子的频率总和/基因座总数

例如：在某一群体中研究了4个基因座，每个基因座上杂合子的频率分别为0.25、0.42、0.09和0.00.对于这4个基因座而言，其H=0.25+0.42+0.09+0.00/4=0.19 （二）形态变异

陆地蜗牛是一种普通的欧洲蜗牛，在欧洲有广泛的分布，几乎所有曾经研究国的群体都发现有多样性，其主要表形在蜗壳五彩缤纷的颜色和条文特征上。蜗牛形态变异的多态性涉及许多对基因。其中最重要的是决定蜗壳底色和决定有、无条纹的基因。 （三）染色体多态性

核型是一个物种的显著特征，然而也并非一成不变，许多物种再染色体数目与形态上有很高的多态性。

如马口鱼的不同种群除臂数外，染色体数目和核型均不相同；泥鳅的不同种群再染色体数目、核型和臂数也不相同。 （四）蛋白质多态性

以凝胶电泳方法对大量物种的蛋白质多态性分析结果显示，有1/3的结构基因是多态的，群体种所有被测基因座的平均杂合度约为10%。这就是说在几乎所有的物种中，对基因组进行扫描分析，将会发现每10个座位中就有1个是处于杂合状态的。

我国学者对长江、珠江、黑龙江的鲢、鳙和草鱼的8个种群的酯酶等16个同工酶位点进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明无论是群体间还是群体内，都存在着明显的蛋白质多态性。 （五）DNA序列多态性

Alec Jeffrey采用性内切酶检测核苷酸序列核苷酸序列多态性的方法，测量了60个没有任何亲缘关系的个体，用以估计人类种DNA全序列的差异，结果显示，在β珠蛋白基因家族中，每100个碱基中就有1个是多态的。

另一种形式的DNA序列差异是从多重复DNA序列中发展出来的性片段方法。

（六）数量性状的变异

大部分重要经济性状都是数量性状，数量性状可遗传变异的存在是经济性状改良的前提。变异系数是衡量数量性状变异程度的指标之一[变异系数=标准差（SD）/平均值×100]。水产动物数量性状的变异系数往往比陆生动物的更大。

第四节 水产动物种质资源的保护

一、我国水产动物种质资源面临的主要问题 （一）水域污染

我国近海和内陆水域污染严重，水生动物环境不断恶化，严重威胁到水生动物的生存和繁衍。

（二）过度捕捞导致的资源衰退

我国有激动渔船48万多艘，其捕捞强度大大超过了渔业资源的良性再生能力。 （三）珍稀濒危物种数量增加，濒危程度加剧 二、濒危物种资源的保护

今年来，我国通过采取一下综合保护措施，取得了较好的效果： （一）保护水域自然环境 1、减小水工建设影响 2、加强水体资源调查管理 3、流域环境的保护

4、水产动物产卵场所环境保护 （二）合理捕捞 1、制止酷捕

2、实行禁渔区（期）

（三）开展濒危水生动物保护生物学研究

（四）建立自然保护区 （五）坚持合理引种 （六）开展人工繁殖和放流 （七）完善法制 （八）加强国际合作

三、养殖种类遗传多样性的研究、保护和利用 （一）建立健全法律法规 （二）应用先进技术

（三）建立天然生态库和原种场 （四）维持发育亲本群体的大小和质量 （五）合理应用遗传育种技术 （六）建立优异种质的配子、胚胎库

第二章 引种和驯化

第一节 引种

一、概述

（一）引种的概念和内容

概念：引种是指从外地或国外引进优良品种或物种使之在本地区繁衍后代并形成一定生物量的工作。

对水生生物而言，引种则是认为进行的不同水域（包括人工水体）之间品种或物种的交流，其结果是引进的物种或品种适应新的水域环境，形成生殖群体的工作。引种主要是利用生物的适应性和遗传、变异性来进行的 引种和移植的区别：

移植是向新的水域引进原来没有的物种，引种则是利用生物现有的适应性区扩大养殖范围和分布区域。有些引种对新的环境不一定适应，因此需要一定乘务的驯化，驯化成功的生物必须改变现有的某些适应性和遗传性，形成变种或品种，而有些引种则仅仅是扩大某一物种或品种的分布区，增加养殖对象而已。有时人们将移植和引种统称为引种。

内容：

引种除了向不同的水体引进经济动物进行养殖生产外，还包括基础饵料的引进。

（二）引种的条件

1、水域的自然资源或生态系统未被充分利用

2、现有水域中的生物群落或神态关系需要改善或改变 3、原有的水产资源遭受毁灭性皮坏后需要恢复 4、外地或国外有适合于本地区水域增养殖的优良品种 （三）引种的目的 1、增加养殖品种 2、改善原有生物群落 3、充分利用水域的自然资源 4、提供饵料生物 5、重新建立鱼类区系 6、提高养殖效益 7、充实现有育种资源 二、影响引种的因素 （一）引种对象的特性

（二）非生物因子对引种的影响 1、温度 2、盐度 3、离子浓度 4、溶解氧 5、营养

6、产卵基质和水文条件 （三）生物因子于引种的关系 1、饵料基础 2、病原生物 3、竞争者 4、敌害生物 三、引种的步骤 （一）确定引种对象

（二）了解引进对象的生物学背景 1、水域生态条件

2、引进种的生物学及其适应能力 （三）引进生物对引进水体的生物学影响 （四）引种材料的选择及放养量 （五）试点及推广 1、引进观察（一点试养） 2、区域试验（多点试养） 3、繁殖推广

（六）引种对象的检疫

（七）引种群体遗传性能的保护 （八）引种的组织和实施 四、我国鱼类引种研究概况 （一）本国野生资源的发掘 （二）外国鱼类的引进

我国陆续由国外引进数十种水生动物，主要有一下几大类：冷水性鱼类，鲤科鱼类，鲇形目鱼类，罗非鱼类及淡水白鲳等。

第二节 驯化

一、驯化的意义

（一）驯化的概念和意义

人类按照自身的意志，将野生动、植物培育成家养动物或栽培植物的过程称为驯化。

（二）驯化的分类

因目的和方法不同，驯化可分为： 1、养殖驯化 2、引种驯化 3、移植驯化 二、驯化的途径

动物引入新的生态环境后对新环境的适应有两个途径： （一）直接适应

（二）定向改变遗传基础 三、驯化的方式 （一）自发驯化 （二）定向驯化 1、极端驯化 2、渐进式驯化

四、影响驯化速度的因素

驯化的实质是驯化对象通过自身的改变适应新环境的过程。

人工驯化事在人为条件下发生的生物进化，进化是可逆的，影响进化进程的因素有3个，即： 1、 自身的遗传因素

2、 所处的环境因素 3、 选择作用

五、 驯化过程的分期

移植对象在新的水域中的驯化会经历以下几个典型的变化时期： （一）驯化对象成活期 （二）形成群体期 （三）最大数量期

（四）新旧物种矛盾尖锐化期 （五）新旧物种动态平衡期 六、驯化结果的评鉴

通常是用下列三家系统评鉴驯化结果： （1）引进对象成活与否 （2）形成繁殖群体与否 （3）生态平衡

第三节 引种对生态环境的影响以及对生物入侵的预防 一、引种逃逸对生态环境的影响

在运输过程种以及在以后的养殖生产的各个环节中，引进的水产动物均有可能会因各种原因发生逃逸，而有些逃逸可能造成的危害不科估量。 （一）已有物种的逃逸

自然水体已有的物种逃逸的话对环境种原有的生物群落影响不大，这是因为水体中原来就有这些物种，只是这种逃逸而来的个体一旦进入交配群体，会在某种程度上改变野生群体的基因频率。 （二）人工育成品种的逃逸

育成品种的遗传的遗传基础已经在很大程度上不同于自然界的原种，因此育成品种逃逸进入自然水体的自然种群之中参与繁殖会对原种的基因库造成污染，除了严重的改变其基因频率，还可能使原种丧失一些重要的遗传性状。 （三）外来物种的逃逸

外来物种的逃逸虽然不回对土著生物造成基因污染，但如果适应了逃逸以后的新环境，无疑会成为生物入侵，会破坏进入水体的生物区系，甚至成为敌害生物。

二、对生物入侵的预防 （一）生物入侵的概念

生物入侵：指植物、动物和微生物从其原生地，经自然或人为途径，传播到另一个环境定居、繁殖和扩散，最终明显影响或改变迁居地的生态环境的事件。 （二）生物入侵的途径

生物入侵途径分为有意引进和无意引进两种。 （三）生物入侵的危害

外来入侵物种通过压制或排挤本地物种，形成优势种群，危及本地物种的生态，最终导致生物多样性的丧失；敌害生物以及敌害病原生物的入侵导致农、林、牧、渔业生产严重受损，甚至人类健康也受到威胁。 1、物种水平上的影响

生物入侵者对被入侵地的其他物种及物种的多样性构成威胁。 2、生态环境

外来物种对生态环境的入侵已经成为生物多样性丧失的主要原因之一。 3、经济上的影响

首先是潜在的经济损失；然后是入侵的直接损失；第三是威胁人类健康的损失。

（四）生物入侵的控制 1、目标敌害生物的确定 2、目标物种的控制

第三章 选择育种

第一节 选择的意义和作用

（一）选择与选择育种

选择就是选优去劣，是指从自然的或人工创造的群体中淘汰不良变异，积累和巩固优良变异的有效手段。

选择育种，简称选种，是根据育种目标，在现有品种或育种材料内出现的自然变异类型中，经比较鉴定，通过多种选择方法，选优去劣，选出优良的变异个体，培育新品种的方法。

生物的可遗传变异是选择育种基础。 （二）选择育种简史

⏹ 选择育种是一种最古老的育种方法，我国在西周时期对品种就有所认识，并却已经形成选种留种技术。

⏹ 选择育种方法的制订应归功与法国的L.de.Vilmorin，他于1856年提出了对所选单株进行后裔测定的原则，这个原则正式现代育种工作者公认的选择知道思想。

选择的意义和作用

选择的意义就在于其创造性作用，具体体现在以下3个方面： 1、控制变异的积累方向 2、促进变异的积累和增加 3、创造新的品质 第二节 选择育种的原理

一、达尔文的选择学说

自然选择：达尔文吧有力变异的保存和有害或不利变异的毁灭叫做自然选择。 达尔文的人工选择分为有意识的和无意识的人工选择两种方式。 人工选择和自然选择的区别：

首先，人工选择进行挑选的是人，发生左右的主题是人为所选择的对象所提供的条件。而在自然选择中，进行挑选作用的是客观自然条件，是受大自然平衡控制的，这与人工选择所定的条件大不相同。

其次，人工选择只能控制少数个体的定向发展，不能形成种群或大群体的定向控制，而自然选择一般则在较大群体种随机交配，交配机会，交配频率只受大自然条件的，与人无关。

最后，由于人工选择控制了交配对象，通过人工选择创造出一个品种只需几年到几十年时间，而自然选择却由于它交配的随机性，形成一个新物种则需要50万到100万年时间，这样的选择效果是与远远不及人工选择的。 二、纯系学说

纯系学说是丹麦植物学家W.L.Jonannsen在1903年提出来的，是纯系育种方法的理论基础之一。纯系学说主要包括以下两个方面的原理：意识在自花授粉植物原始品种群体内，如果通过单株选择，可以分离一些不同的纯系，这表明原始品种是纯系的混合物。二是同一纯系内继续选择是无效的，因为同一纯系内各个体的基因型是相同的，他们出现的变异是受外界各种环境因素影响的结果，这种变异只影响了当代个体的表现型。所以是不可遗传的。 第三节 育种性状的选择

水产动物的育种性状分为质量性状和数量性状两大类。

质量性状是指品种的一系列符合孟德尔遗传定律、呈间断变异的性状。 数量性状是指那些占多数、呈连续变异的、个体间表现的差异只能用数量来区别的客观指标如体长，体重，生长量和声场两的一系列的变异性状。 一、质量性状选择

（一）质量性状选择的遗传效应

对质量性状选择的基本哦年工作是对特定基因型的判别。选择并不产生新的基因，但它可增加一个群体种某些理想基因额的频率，同时降低不理想基因的频率。

质量性状选择的遗传效应在于提高被选择基因的频率，并减少被淘汰的基因的频率。随着合意基因频率的提高，有利基因的纯合个体的频率也提高。 （二）对基因的选择

对隐性基因的选择实际上是对线性基因的淘汰过程。根据育种目标，如果受选的是有基因控制的，就必须对隐性进行选择，保留显露出隐性性状的个体，也就是培育所选中的隐性纯合基因型个体。 （三）对显性基因的选择

根据育种目标，如果受选的性状是由显性基因控制，则对该性状选择实际上是对显性基因的选择。

对表形型相同的个体，就存在两种可能的基因型：一是显性纯合子，二是隐性杂合子，这样，在选择显性基因时不仅要淘汰隐性基因纯合体，还要在显性表形种区分显性纯合子和杂合子，淘汰杂合子。淘汰需分两步进行：

第一步,根据表现型淘汰掉隐性纯合体，并将具有显性性状的个体作为亲本繁殖；

第二步，将选作亲本的显性个体测交或自交，然后根据测交或自交结果，吧杂合体淘汰掉，只留下全部显性纯合体。 （四）对杂合子的选择

如果受选性状的变现型是受杂合基因型（Aa）控制，其等位基因是共显性、不完全显性或镶嵌显性，就非常容易根据表现型区分纯合子和杂合子。纯合子（AA、aa）的表型与杂合子（Aa）的表型区别极大，只需要通过直观观察即可选出。

（五）对半性基因的选择

⏹ 在一些水产动物中，性别受性染色体控制。在性染色体上，除了有决定性别的基因外，还有控制其他一些性状的基因。凡是性染色体上的基因控制的性状总是伴随着性别而遗传的，所以叫伴性遗传，也叫性连锁遗传。 二、数量性状选择

（一）表型方差分析的数学模型

数量性状变异中，从观测值 难以推算其基因型。遗传学理论认为，基因型值（G）和表现型值(P之间存在数量相关关系： P=G+E+I

其中，G是由某个体的一数量性状基因型所决定的部分，E是由某个体的性状受到环境作用而产生的偏差，I是基因型和环境的互作偏差效应值。

对大多数的数量性状而言，基因型效应和环境效应之间没有互作，或互作很小，为简化对数量性状遗传规律的探讨，一般假设IGE=0，则上述模型简化为：P=G+E

这一模型的意义正如孟德尔理论那样，将表型值与基因型值加以明确区分。表型值是由遗传效应和环境效应共同决定的，遗传效应是产生表型变异的内在原因，环境效应是表型变异的外部原因。 （二）遗传力分析

数量性状的变异的遗传程度可用遗传力（）指标来评定， h2 =VG /VP是广

义遗传力。在基因型方差的3个因素中，仅使用相加性遗传方差VA的遗传力，称为狭义遗传力， h2 =VA /VP。在育种时间中常使用狭义遗传力。

遗传力也表示种群的性状特征。

遗传力的推断基本上采用方差分析法、相关分析法和回归分析法，具体可分

为：1、亲本与子代相关或回归分析；2、完全同胞或半同胞的方差分析；3、选择试验结果的分析；4、求平行组的方差分析。 （三）选择参数估计

数量性状的选择效果受性状的变异程度、性状的遗传力和人工选择三方面因素影响。用以说明人工选择情况与效果的参数有选择差、选择强度、选择压力、选择反应和世代时间等。

1、选择差数（S），是指已选择个体性状的平均值与选择前整个群体改性状平均值间的差数。

2、选择强度（I）是标准话的选择差，在数值上等于选择差（S）除以背选择群体的表型值标准差（δ），即I=S/ δ。群体的表型值标准差δ是描述群体性状表型值变量离中程度的一个指标，反映群体性状表型值变异的大小。

3、选择压力（P）是指选作育种对象的个体数（n）占选择前群体总个体数（N）的百分比值。也称中选比率，即P（%）=n/N×100。 4、选择反应（R）是一种衡量选择效果的指标，指受选择性状经一世代的选择后，性状平均值变化情况，在数值上等于选择亲本所繁殖的子代表型平均（Yf）减去选择前群体的表型平均值（Y），即R=Yf-Y。 5、世代间隔（G）是指子代出生时其父母的平均年龄。 （四）数量性状间的相关关系

生物作为一个有机的整体，它所表现的各种性状之间必然存在着内在的联系。从数量遗传学这一角度，可以采用遗传相关来描述不同性状之间由于各种遗传原因造成的相关程度大小，应该与亲属个体间的亲缘相区别开。

表型相关就是两个数量性状表型变量的相关。另一类由于两个性状受个体所处相同环境造成的相关称之为环境相关。 第四节 选择育种的方法 （一）选择育种的程序

个体选择是根据个体性状的表现型进行选择的方法，又称之为混合选择或集体选择。对于以遗传力较高的性状采用改选择方法简单易行，且容易成功。选择的具体过程如下： 选择的具体过程 （二）家系选择

在尽可能一致的环境条将虾，建立若干个家系，并对家系进行比较和观察，以家系为单位进行选择。将具有目标性状和优势性状的个体选出来作为亲本繁育，逐代选择表现良好的个体，这种选择育种方法称为家系选择。 1、家系选择工作内容

（1）原始群体优势性状的总和评估分析 （2）近亲交配和严格选择

（3）系谱档案的建立、记录与整理 2、家系选择的选择效应

3、家系选择的对比试验

对于不同家系的水产动物可以进行丹阳或者做标记后同池混养进行对照试验。 （三）后裔鉴定

1、后裔鉴定的遗传学基础

两性繁殖生物的受精过程表明，父本与母本为其后代个贡献一般的遗传物质，即每一后代从每一亲本得到一半的遗传物质。由于决定子代平均基因型值的是其亲本基因，因此对一个亲本个体的遗传评价就可以根据其子代的平均数值来进行。

2、鱼类测定亲鱼的选配实验

在鱼类育种时间中，目前仍沿用前苏联学者总结的亲鱼后裔鉴定的方案。 （1）成对亲鱼的后裔比较鉴定

（2）简单多系相互交配鉴定单一性别亲鱼 （3）完全多系相互交配亲鱼后裔鉴定 （四）综合选择法

所谓综合选择是将家系选择、混合选择和后裔鉴定等选择技术相结合进行的选育种。其特点是结合每一选择方法的优点，克服单一选择方法的一些技术难点。综合选择的实施步骤如下：

第一阶段，采用无亲缘关系的品种、种群等杂交建立若干家系，并通过养殖对比实验对这些家系做出生产性能鉴定，选出变现优良的家系

第二阶段，在2~3个较好的家系种进行个体选择，每个家系有几千尾鱼时，可以采用较大的选择强度和较高的选择压力

第三阶段，根据后代的表现评价每个家系的质量，进而确定每个家系的育种价值。

二、多性状的选择 （一）顺序选择法

顺序选择法又称一次选择法或单项选择法，是指针对计划选择的多个性状逐一选择，每个性状选择一代或几代，代得到满意的选择效果后，再选择第二个性状，然后在选择第三个性状等，顺序梯选。 （二）淘汰法

也称水平法或限值淘汰法，即将所要选择的个性状分别确定一个选择界限，凡是要留种的个体，必须同时超过各性状的选择标准。 （三）综合指数法

综合指数法是按照一个非的选择标准确定旋流个体的方法，将所涉及的各性状，根据其遗传基础和经济重要性，分别给予适当的加权，然后综合到一个指数中。

第五节 影响选择效果的因素和提高 选择效果的途径 一、影响选择效果的因素 （一）选择对象的内部因素 （二）人为因素 （三）生态环境

二、提高选择效果的途径 （一）把握育种目标

（二）合理地选择育种原始群体 （三）最适宜的选择时间 （四）选择的标准

（五）对优势个体进行选择的条件 （六）选择个体的数量和时期 第六节 水产动物选择育种实例 一、鲤的增重量选择实验 二、道纳尔逊“超级虹鳟” 三、建鲤

四、中国对虾 “黄海1号” 第四章杂交育种

杂交：在遗传学上将只要有一对基因不同的两个个体进行交配的过程称为杂交。

杂交育种：通过不同品种间杂交创造新变异，并对杂种后代培育、选择以育成新品种的方法叫杂交育种。其理论基础是基因的分离和重组。

杂交育种分类方法多种多样。依据杂交亲本亲缘关系远近的不同，可分为近缘杂交进而远缘杂交；依据育种目标的不同，可分为育成杂交和经济杂交；依据杂交时通过性器官与否，分为有性杂交和无性杂交；依据杂交时参加亲本数目的多少，分为单交和复交。 第一节 育成杂交 一、育成杂交的概念

所谓育成杂交，就是指将分属不同品种（品系或自然种）、控制不容性状的基因随机结合，形成各种不同的基因组合，再通过定向选择定向选择育成集双亲优良性状于一体的新品种的育种方法。其遗传机理是基因重组和互作。 根据杂交的方式，育成杂交分为4类： 多品种综合育成杂交 二、简单育成杂交

又称增殖杂交，是根据当地、当时的自然条件、生产需要以及原地方品种品质等条件的，从客观上来确定育种目标，应用相应的两个或多个品种，使它们各参加杂交一次，并结合定向选育，将不同品种的优点综合到新品种中的一种杂交育种方法。

根据引入杂交品种的多少和所用的技术条件，各品种的生物学特性等，又可分为二品种简单育成杂交和多品种简单育成杂交。

三、级进育成杂交

又称吸收杂交、改造杂交、渐渗杂交，是根据当地的自然条件、经济条件和生产需要以及原有地方品种品质等所客观确定的育种目标，将一个品种的基因逐渐引进到令一个品种的基因库种的过程。

四、引入育成杂交

又称导入杂交，改良杂交，是为获得更高经济效益或根据当地的自然条件、经济条件和生产需要以及原有地方品种品质等多客观确定的育种目标，通过引入品种对原有地方品种的某些缺点加以改良二使用的杂交方式。 五、综合育成杂交

此法是为了获得更大的经济效益，根据当地的自然条件，生产需要和原有地方品种的品质等客观条件二确定的改造某一地方品种或品系而进行的育种活动。 根据参加杂交的品种数目的不同，又分为二品种综合育成杂交育种法和多品种综合育成杂交育种法。 六、育成杂交的步骤

（一）确定目标和育种方案 （二）杂交组合的选择 1、选择亲本 （1）精选亲本 （2）明确目标

（3）重视选用当地推广品种 （4）明确亲本性状的遗传规律 2、亲本的选配

（1）双亲性优良，优缺点互补 （2）双亲遗传差异性要大 （3）双亲配合力要高 （4）亲本目标性状要突出 （三）对杂种后代的选择

（四）理想个体的子群繁育与理想性状的固定 （五）扩群提高 七、杂种后代的处理

此阶段 的主要目标是固定优良性状，稳定遗传特性，其实质是有杂交繁育向纯种繁育过度。主要方法是： （一）近交选育

遗传学上将有亲缘关系个体间的交配称为近亲交配，简称近交。 1、近交的遗传效应

近交的遗传效应表现在以下3个方面：

一是杂合体通过近交可导致后代基因的分离，并使后代群体的遗传组成迅速趋于纯合化；近交后代纯合体增加的速度决定于近交系数、等位基因的对数和近交的代数。

二是导致杂合体等位基因的纯合使隐性有害的性状表现出来，也就是常说的近交衰退。

三是杂合体通过近交可使遗传性状重组和稳定，使同一群体出现多个不同组合的纯合基因型，而且逐代趋于稳定。 2、近交的作用 （一）揭露有害基因

（二）可以保持个体血统的纯正 （三）可以提高种群的同质性

（四）可使基因纯合，因此可以利用这种方法来固定优良性状 3、近亲交配衰退

近亲交配虽有需对用途和优点，但也存在不利之处，即有可能产生近亲交配衰退。

（二）回交选育

1、回交育种的概念和意义

回交是指杂种后代与亲本之一再行杂交。回交育种是指两品种（品系）杂交后，通过用杂种与亲本之一连续多代重复杂交，把亲本的某些特定性状导入另一亲本的育种方法。

回交育种是杂交育种的一种特殊形式，也是处理杂种后代的特殊方法之一。它为育种提供了一种较为精确的控制杂种群体、选育改良的方法。

2、回交育种的特点 （1）优点： ⏹ 遗传变异易控制 ⏹ 目标性状选择易操作 基因重组频率易增加 所育品种易推广 （2）缺点

回交育种只改进原品种的个别缺点，不能选育具有多种新性状的品种，因此

回交对品种的改良不可能获得多方面的重大改进，除非育杂交育种相结合，这是回交育种法的最大弱点；

回交改良品种的目标性状多局限于少数主要基因控制的性状，其遗传力高，又便于鉴别，易取得成功。若用来改良的是数量性状，则难以奏效。

从非轮回亲本转移某一目标性状的同时，由于与不利基因连锁或一因多效的

缘故，可能将某些不利的非目标性状基因也一并带给轮回亲本。为此，必须进行多次回交，才能打破连锁。

回交的每一世代都需要进行较大数量的杂交和选择，工作量较大。

3、回交育种的基本遗传规律

回交的遗传效应有两个方面：首先，连续回交可使后代的基因型逐代增加轮回亲本的基因成分，逐代减少非轮回亲本的基因成分，从而使轮回亲本的遗传组成替换非轮回亲本的遗传组成，导致后代群体的性状逐渐趋向轮回亲本。其次，回交可以导致基因型纯合。 在应用回交时，必须注意以下两点： 一是应该选择好的轮回亲本；

二是非轮回亲本的选择也十分重要，它是被改良性状的唯一来源。 4、回交次数

理论上回交4次后，其后代的经济性状将与轮回亲本极为相似。但在实际工作中，应视具体情况而定。 （三）杂种后代的培育和管理

在杂种后代的培育过程中，应注意以下几点： 保证杂种后代正常发育以供选择； 培育条件要均匀一致； 大水面饲养杂交种要慎重。

第二节 杂种优势利用

一、杂种优势的概念及特点 （一）杂种优势的概念

所谓杂种优势是指两个或两个以上不同遗传类型的个体杂交所产生的杂种第一代，往往在生活力、生长势和生产性能等方面在一定程度上由于两个亲本种群平均值的现象。 （二）杂种优势的特点

杂种优势不是某一两个性状变现突出，二是许多性状综合地表现突出； 杂种优势的大小，大多取决于双亲性状间的相对差异和互补程度； 亲本基因型的纯合程度不同，杂种优势强弱也不同； ⏹ 杂种优势在杂种第一代表现最为明显，之后就显著降低。 二、杂种优势的理论基础 解释杂种优势的三个论点 （一）显性学说

显性学说也叫显性基因互补或显性连锁基因说，是由Bruce（1910）提出，经Jones（1917）和其后一些人的补充发展而成。该学说认为显性基因多为有利基因，有害、致病以及致死呼吁大多是隐性基因；显性基因对隐性基因有抑制和掩盖作用，从而使隐性基因的不利作用难以表现。显性基因在杂种群中产生累

加效应。非等位基因间的互作会使一个性状受到抑制或增强，这种促进作用可因杂交二表现出杂种优势。 （二）超显性学说

该学说又称则和假说，是Hull和East于1908年分别提出的。这个假说热为杂种优势是等位基因间相互作用的结果。由于具有不同作用的一对等位基因在生理上互相刺激，使杂合子比任何一种纯合子在生活力和适应性上都更优越。 （三）遗传平衡学说

该学说认为，杂种优势是各种遗传过程相似作用的总效应，所以根据遗传因子相互影响的任何一种方式而提出的假说均不能作为杂种优势的一般理论。 三、杂种优势的度量

现在通常所用的度量法根据衡量优势强度所用的技术不同主要有以下几种。 （一）杂种优势率

所谓杂种优势率（又称杂种效果），就是指在某性状上，F1的计量平均值与双亲平均值之差，而杂种优势的大小通常以杂种优势率表示。杂种优势率（又称超中优势率）就是指在某性状上，F1的计量值与双亲平均值差数的比率。 （二）超亲优势率

所谓超亲优势率（又称真杂种优势率），就是指在某种性状上，F1的计量平均值与高值亲本平均指差数的比率，计算公式为： （三）超标优势率

所谓超标优势率，就是指在某种性状上，F1的计量平均值与当地推广品种平均值差数的比率。计算公式为： （四）杂种优势指数

所谓杂种优势指数（HI），就是指在某种性状上，F1的剂量平均值与双亲平均值的比之。计算公式为： 四、杂交亲本的选择

杂交亲本种群的选择需要注意类别，初选以及选育三个问题。 （一）亲本群的类别

1、品系——杂交组合多由品系配置；

2、品种——在某些特殊条件下，可用品种替代品系。 （二）亲本群的初选

在进行试验前，需要对亲本群进行初步估计，这样就可以起到事半功倍的效果。

目前常用的初选方法有遗传差距法和配合力法两种。 （三）亲本群的选育

亲本群的选育主要包括选优、提纯两个方面。选优就是通过选择，选出性能优良、合乎理想的个体。提纯则是通过选配，使亲本群在主要性状上纯合子的基因频率尽可能增加，个体间差异减少。 五、杂交组合方式 六、鲤的纯种优势利用 1、丰鲤

兴国红鲤♀×散鳞镜鲤♂杂交得F1 2、建鲤

荷包红鲤♀×元江鲤♂杂交后采用家系选育，F1经三代自交和一代系间杂交得F4，用两个雌核发育系与的F4杂交得F5-F6代，然后选育成性状稳定的鲤鱼优良品种

第三节 远缘杂交

远缘杂交：是指亲缘关系比较远的生物类型之间的杂交，即起码是种与种之间的杂交。从分类学角度来说，不仅有中间杂交、属间杂交，和亚科间杂交，甚至有科间和目间的杂交，以区别种内的不同地理种群间的杂交。 一、远缘杂交育种概况 二、水产动物远缘杂交的特点 （一）远缘杂交的可孕性

水产动物远缘杂交较易进行，主要原因可能是多数为体外排放精卵，体外受精易进行操作。

实际应用中的主要问题：杂交不孕和杂种不育。

杂交不孕：是指不可交配性，即由于亲缘关系远，使两个物种的生殖细胞产生配子各类而不能正常受精、胚胎不能正常发育，因而不能获得有生活力的后代。

杂种不育：是指亲缘关系较远的物种彼此能够获得杂种但因其胜利功能不协调，生殖系统遭受干扰而杂种不能繁殖后代或繁殖力很低的现象。

生殖隔离（杂交不育）是物种育物种之间的分界线，是鉴定物种的最基本的依据。造成生殖隔离的原因一般可大致分为地理隔离、季节隔离和生理隔离3种。

地理隔离：由于地理因素造成的隔离，长期的隔离阻断了两物种之间的基因流动，进而导致生殖隔离。

季节隔离：由于动物繁殖季节不同，即使在同一地区也无法交配，因而你造成的隔离。

生理隔离：动物存在性选择，只选择或接受同种的异性个体交配，而拒绝一种的异性个体。

（二）远缘杂种的可育性

1、种间杂种：同一属内的不同种间杂交，比属间杂交的可育性大，有许多完全可育（全育型）的种类。

2、属间杂种：不同属间的远缘杂交，则出现杂种能育性较为复杂的情况—— 完全可育、完全不育、单性可育。

3、 亚科间杂种：不同亚科间的远缘杂交，至今未见报道能育的杂种，一般认为是不育的。

（三）远缘杂交不相容性的主要原因

引起杂交不相容性的主要原因可能有以下3个方面： 1、核型差异

2、基因位点及基因表达的差异 3、核质不相容 （四）杂种的生活力

不同杂交组合间的生长和生产性能差异显著。两个物种杂交，大多数情况下，杂种生活力提高，产生杂种优势。有些远缘杂交的杂种生活力无明显改变。第三种情况是杂种生活力降低，产生杂种劣势。 （五）促使远缘杂交可孕和克服远缘杂种不育的方法 1、亲本的选择和配组

选择杂交亲本时首先要考虑它们的血缘关系的远近，正确选择远缘杂交亲本并进行合理的配组，是远缘杂交的关键。 2、混合受精

混合受精优势可以克服远缘杂交的不孕性。 3、诱发多倍体和单性发育

远缘杂交即”异种受精“，在亲和力较强的配组中杂种可育，但当核型存在差异时可能产生两种结果：诱发多倍体和单性发育 三、远缘杂交的实例及应用前景 （一）鲤科鱼类的远缘杂交 （二）鲟科鱼类的属间杂交 （三）鳟鱼类的远缘杂交 （四）罗非鱼类的种间杂交 （五）贝类的远缘杂交 （六）虾蟹类的远缘杂交

第五章 雌核发育与雄核发育

第一节 雌核发育

一、雌核发育现象

雌核发育：指卵子在精子的刺激下，依靠自身的细胞和发育成个体的一种有性生殖方式。

与一般两性生殖物种的单倍体卵子不同，雌核发育种类产生卵子的染色体数目仍与体细胞的染色体数目相同，称为非减数卵子。当精子进入卵子后，仅起激

活作用，不发生原核化，不与雌性原核融合，因而是一种无融合的繁殖方式，所产生的后代完全与木本相似。

在自然界中，营天然雌核发育的动物种类很少，其中最著名的例子是银鲫。 人工雌核发育是指用遗传是活的精子激活卵子的发育，精子不参与合子核的形成，卵子仅靠西河发育成胚胎的现象。1911年Hertwig首次发现了人工雌核发育的可能性。

雌核发育二倍体的人工诱导有多种方法，但都要通过两个步骤实现，即精子染色体的遗传失活以及卵子染色体的二倍体化。 二、精子染色体的遗传失活与雌核发育的诱导

精子染色体的遗传失活是人工诱导雌核发育的关键技术。目前，失活精子所采用的方法一般包括γ射线，X射线，紫外线，化学试剂，杂交诱导等。 三、雌核发育二倍体的诱导

用遗传失活的精子与卵子受精，发育出来的胚胎通常为单倍体。这样的个体通常不能正常的生存。要获得具有生存能力的雌核发育个体，除遗传失活精子之外，还必须通过抑制第一、第二极体的释放或早期卵裂恢复乱则染色体的二倍性。

（一）诱导原理

鱼类只能通过抑制第二极体或第一次卵裂两种方法产生雌核发育二倍体。 贝类雌核发育二倍体的人工诱导可以通过抑制第一极体、第二极体释放或第一卵裂3种方法获得。 （二）诱导方法

人工诱导雌核发育二倍体，也就是是雌核发育的单倍体加倍的过程，主要有物理学方法，化学方法和生物方法。 物理学方法有温度休克法，静水压力法；

化学方法有CB处理法，6-DMAP处理法，秋水仙素、聚乙烯乙二醇、三氯甲烷和氯化钙等化学试剂处理法。 （三）雌核发育二倍体实例

在20世纪80年代依赖，人们对鱼类雌核发育二倍体的诱导技术进行了大量研究，迄今已获得人工雌核发育二倍体鱼类30多种。然而，在海产经济贝类方面，人工西河发育研究开展较晚，至今还没有培育到成体的报道。 四、雌核二倍体的鉴别

采用理化方法人工诱导雌核发育，由于人工失活精子的处理并非百分之百成功，倍化率也因处理条件和诱导方法不同又很大差异，因而当雌核发育二倍体产生的时候，必须又充分的证据证明染色体数目的二倍性，且精子DNA确实没有参与胚胎发育，因此雌核发育个体的倍性检测和鉴定是雌核发育二倍体诱导中的一个重要环节。

常用的鉴定方法有：流式细胞仪检测法，荧光显微分析法，染色体分析法，同工酶电泳方法，分子标记鉴定等。 五、雌核发育二倍体的受精细胞学机制

在鱼类的人工诱导雌核发育研究中，一般认为入卵后的精核始终受到抑制，而不形成雄性原核，保持固缩状态，不育雌性原核融合，精核仅起激活卵子启动发育的作用。

六、雌核发育二倍体的生物学特性 （一）性别

自然界大部分鱼类是雄性异型（XY型），因此这类鱼的雌核发育后代应该全部是雌性（XX型）。若是雌性异型的鱼类（ZW型），西河发育后代的性别结果则是雄性（ZZ型）和雌性（XX型）各占一半。因此，通过分析雌核发育后代的性别比例就可以了解该动物的性别决定机制。 （二）繁殖力

吴清江等（1999）认为通过物理或化学方法加倍的鱼类雌核发育个体，大约有80%的性腺不能正常发育，而染色不完整是人工雌核发育鱼类不育的主要原因。

（三）生长与发育

总的来说，雌核发育所产生的后代与正常受精所得到的胚胎相比发育速度变慢，成活率低。

七、雌核发育二倍体的遗传学特性

根据卵子染色体加倍的时期不同，雌核发育二倍体划分为3种类型：第一极体抑制型，又称为减数I型雌核发育；第二极体抑制型，又称为减数II型雌核发育；第一卵裂抑制型，又称卵裂型雌核发育。

谷口（19）使用x[基因（G）-着丝粒（C）重组率]、y（第二次分离频率）和F（近交系数）3个参数描述了这3种类型雌核发育二倍体的遗传学特性。

⏹ 抑制第一极体释放诱导雌核发育二倍体时，如果不发生重组，子代都将成为母本的拷贝。但由于现实中往往发生重组，因而距离着丝粒近的基因位点保持着母本的杂合性，距离着丝粒远的基因位点则出现同组结合2型、异祖结合2型，共4种类型的卵子，第二次分离（杂合体）的频率y=1-x。依染色体上基因位点的不同位置，y值为0.5~1.0.因此，近交系数F也随基因位点变化而变化，其值为0~0.5、

⏹ 抑制第二极体释放诱导雌核发育二倍体时，如果不发生重组，子代都应成为瓦健全的纯合体。由于鱼类的染色体一般都发生一次交叉，因此距离着丝粒近的基因位点为纯合体，距离着丝粒远的基因位点，G-C重组率为x时2x的卵成为杂合体，即y=2x。这个比例根据基因位点在染色体上的位置而变化，y为0~1.0.因此，近交系数F也随基因位点变化，介于1.0~0之间。

⏹ 抑制第一卵裂诱导雌核发育二倍体时，由于是抑制了有丝，不存在基因重组，因而在所有的基因位点都是纯合体（y=0），近交系数F=1-y=1。 八、雌核发育二倍体在遗传育种中的应用

在遗传学基础理论和水产养殖应用研究中，雌核发育有着十分广泛的应用前景，如生产利用异育银鲫，快速建立纯系，并通过纯系间杂交选育个体大、生长快，和抗逆性强的优良新品种；用于基因定位，基因-着丝点作图；用于性别决定机制及其他基础遗传学研究。 （一）异育银鲫； （二）快速建立纯系；

（三）性别控制和单性种群利用； （四）确定性被遗传机制； （五）基因-着丝点作图。

第二节 雄核发育

一、卵子染色体的遗传失活与雄核发育的诱导

雄核发育是指通过用放射线照射等方法完全破坏卵核，仅把卵子作为营养源，依靠精子又来的精核发育成胚胎的现象。

卵子遗传失活常用γ射线和X射线的辐射处理，照射剂量与发生率之间，与雌核发育同样可以看到Hertwig效应。 二、雄核发育二倍体的诱导

雄核发育二倍体的偶到可以通过抑制第一次卵裂的方法获得。此外，还可以通过双精子融合，或利用四倍体得到的二倍体精子或遗传失活卵受精的方法获得雄核发育二倍体。 三、雄核发育后代的性比

雄性异型鱼类的雄核发育二倍体，理论上应该产生XX雌性和XY雄性（超雄），并以1：1的比例分离。雌性异型配子的雄核发育二倍体，理论上应该全是ZZ雄性，与正常雌性交配性比正常。 四、雄核发育的应用 （一）濒危物种保护 （二）全雄生产 （三）克隆

（四）有害隐性基因的排除 （五）核质杂种

第六章 多倍体育种

染色体是遗传物质DNA的载体，是细胞中遗传物质存在的形式。不同种生物的遗传物质、遗传性状互不相同，其染色体数目和染色体形态也不尽相同；同种生物的染色体数目和形态则完全相同，所以染色体数目和形态特征是物种的标志。各种生物在世代交替中，染色体数目具有相对的稳定性，每种生物体细胞都有相对恒定的染色体数目。

第一节 生物染色体的多倍性

一、多倍体概念和种类

（一）多倍体最早是有德国学者温克勒诱发植物多倍体成功后提出来的。它指生物体体细胞中含有3个或3个以上染色体组的个体。相对与二倍体，多倍体的体细胞中含有3个、4个、6个或更多的染色体组，而依次贝称为三倍体，四倍体，六倍体等。 （二）多倍体的种类

同源多倍体：从来源上分析，如果加倍的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，则称为同源多倍体（homologous polyploid）。 异源多倍体：如果加倍的染色体来源不同的物种，则称为异源多倍体（heterologous ployploid）。 二、多倍体现象

多倍体在植物界很普遍。被子植物中大约有一半的物种是多倍体。但动物中的多倍体现象较少。在水产动物中，多倍体现象比较普遍，许多多倍体种类是重要的经济鱼类或重要的经济鱼类或重要的养殖对象。 三、天然多倍体形成的原因 （一）体细胞染色体加倍

由于生物自身或外界的原因，体细胞在有丝中期发生分异常现象（核内有丝、核内复制或后两个子细胞的融合）导致染色体加倍失败，形成染色体数目加倍的多倍体细胞，进而形成一定的多倍体组织或器官。这种多倍体的组织或器官在动物和植物都可能出现，但植物比动物更容易流传下去。

有体细胞的核内有丝（核内复制）和细胞融合导致的多倍体均为偶倍性。 核内有丝：是体细胞在正常有丝中，染色体复制一次，但至中期，核膜没有破裂、消失，也无纺锤丝的形成，当然也不会发生细胞中后期的细胞质，因此每个染色体形成4条染色体，称为双倍染色体，这时染色体两两平行排列在一起，结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞，形成两个子细胞均为四倍体。

细胞融合：指两个细胞之间由于某种物质作用，细胞膜之间融合，形成一个双细胞核细胞，由于细胞有丝时的核膜崩解，两个细胞核融合形成一个细胞的过程。这一过程发生在第一次卵裂形成的两个细胞之间，虽然是体细胞之间形成的多倍体，但由于用以后的生殖细胞也由之形成，故由此产生的四倍体是可遗传的。

（二）生殖细胞的异常减数

生殖细胞可能发生异常的减数，由于某种原因同源染色体或姐妹染色体在后期没有分开，二组染色体进入到同一配子中，导致配子中染色体数目的加倍形成2n配子。这样的配子经受精后形成倍性不同于亲代的多倍体，但其子代的可育性很低。 （三）双（多）精受精

动物的受精机制保证只有一个精子进入卵子。在一些鱼类中是精子产生雄配子素II，溶解卵膜孔的乱摸形成受精孔。卵子的卵膜孔区有两种雌配子素，雌配子素I有吸引和加速精子活动的作用。当一个精子进入卵子后，卵子立即释放雌配子素II，使卵膜孔封闭，并破坏贝吸引到卵表面而不能键入卵的精子。由于雌、雄配子素的共同作用，最好中使一个精子的头部由卵膜孔入卵，实现精卵的两核融合。当卵子的受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时，则可能有两个或多个精子进入卵子，并同时完成受精过程，进而形成三倍体（双精），四倍体（三精）的合子，并发育形成多倍体个体。这种双（多）精受精的生物现象在植物，动物以及高等动物中均有发现。在自然界中靠自然力量形成多倍体的机制还不清楚，目前还没有通过这种方法人工诱导产生多倍体的先例。 （四）远缘杂交

不同二倍体物种之间杂交，当血缘关系比较近时形成异源二倍体杂种；当杂交的两个物种血缘关系较远，会产生杂交种不育现象；如果遗传基础差异较大，杂交很难获得二倍体杂种，但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成，这一现象在鱼类等水产动物的远缘杂交中经常出现，尤其是辅以一定的技术手段处理后更加容易获得异源多倍体。高等动物的远缘杂交能力较弱，而许多植物则能形成可育的异源多倍体。 （五）个体发育调节机制

植物有着复杂而完善的急速调节作用，但其精确性和时效性不及动物，对遗传物质改变的耐受性较大，这样就容易在自然选择中形成多倍体。而在动物体中，染色体、神经、体液调节的存在，对配子的产生、合子的形成、性别决定和子代个体的发育有着重要的影响。多倍体动物之所以稀少，可能与染色体的性别决定有关。

第二节 多倍体诱导

多倍体育种包括天然多倍体的挖掘和人工多倍体的诱导两个方面。由于天然多倍体已经镜鲤长时间的适应与自然选择，因而在适应环境和综合表现等许多方面具有优势。但在自然界中，多倍体自然发生的皮率极低，尤其是天然多倍体发生的年代较为久远，数量有限，难以全面满足人类对养殖新品种开发热情。因此，人工诱导多倍体便成为多倍体育种一个更好的选择。 一、人工诱导多倍体的原理

根据天然多倍体的生成机制以及生殖细胞发生和细胞的机理，多倍体的诱导原理有以下几方面： （一）抑制第一极体的释放 （二）抑制第二极体的释放 （三）抑制第一次卵裂 （四）细胞融合

二、人工诱导多倍体产生的方法

目前广泛应用的诱导方法有物理学方法，化学方法和生物学方法。 （一）物理学方法

该方法主要有温度休克、静水压力处理和电休克法等 （二）化学方法

一些化学物质可以破坏细胞中纺锤体的形成，进而组织卵细胞极体的排出或受精卵的有丝而产生多倍体，这些化学物质有：秋水仙素、细胞松弛素B、聚乙二醇、6-二甲基氨基嘌呤、咖啡因等。 （三）生物学方法

该方法主要有远缘杂交、核移植及细胞融合等。

第三节 诱导多倍体的细胞学特征

（一）抑制受精卵第一极体释放的染色体分离方式

Guo等（1994）对牡蛎（2n=20）受精卵的细胞学观察研究中发现，经CB处理抑制第一极体释放后，在第二次减数过程中，染色体的分离方式有以下几种：

1、联合二极分离 2、随即三极分离 3、非混合三极分离 4、二极分离

（二）抑制受精卵第二极体释放的染色体分离方式

抑制受精卵第二集体释放的染色体分离方式因种类不同而不同。在此一太平洋牡蛎为例说明抑制第二极体释放的遗传结果。

受精时，卵子处于第一次减数的前期，含有20个四分体，受精后卵子继续减数过程，同源染色体向两极一定，20个四分体均分为两组，每组10个，其中靠近卵子边缘的一组形成第一极体排出。剩余的一组继续第二次减数，染色单体分开，向两极移动，每一极含有10条染色单体，靠近卵缘的一极将形成第二极体排出。在第二极体释放前，细胞核内形成2倍体的雌性原核（20条），再与正常的雄性原核（10条）结合就形成三倍体（MII三倍体）。

第四节 多倍体的鉴定

由于经人工处理的受精卵不能保证百分之百地称为多倍体，而且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此进行染色体倍性鉴定对于确认诱导效果就显得十分必要。鉴定方法分为直接和间接两种方法。直接方法包括染色体计数和DNA含量测定等，间接方法包括细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查。 一、染色体计数法

（一）鱼类染色体玻片标本制备 1、肾脏组织染色片法

2、小型鱼类鳃细胞制片 3、胚胎细胞制片 （二）贝类染色片法 1、用单轮幼虫制备染色体标本 2、用鳃组织制备染色体标本

3、用上足触手、外套膜制备染色体标本 二、细胞核体积测量

一般认为，真核细胞的核大小与染色体数目成正比，同时细胞核与细胞质在细胞种总是维持较稳定的核质比。因此，细胞及细胞核体积的大小可用于染色体倍性鉴定。 三、极体计数法

极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测。因为三倍体的诱导是通过组织第一极体或第二极体的排出而完成的，所以三倍体合子只有一个而不是两个极体。具体方法是在显微镜下观察卵子的动物极有没有极体释放。

四、DNA含量测定方法

细胞核内的DNA含量与它们所含的染色体数成正比，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，所以可以通过DNA含量来确定染色体数目的多少。其具体方法有：流式细胞仪检测法、显微荧光测定法、同位素标记测定法。

第五节 多倍体的生物学特性

（一）性腺发育

人工诱导的三倍体鱼类理论上是不育的，因为计数染色体组将导致减数因姊妹染色体配对不平衡而不能进行，由此引发性腺发育的受阻或非整倍体配子的产生。

迄今为止的研究结果显示，人工诱导三倍体贝类的性腺发育大致有3种类型：第一种是三倍体的性腺成熟完全被抑制；第二种是性腺发育虽受到一定程度的抑制，但在产卵期仍有不同程度发育，且随种类不同而有很大差异，有些能产生成熟的卵母细胞和精子。第三种类型是有些三倍体贝类产生的精、卵能正常受精并发育。

四倍体个体的性腺发育正常，但育性较二倍体差。 （二）生活力与生长

大多数学者的研究发现，人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力。

除在贻贝的幼虫发现三倍体与二倍体的生长存在差异外，多数研究认为，贝类达到成熟期后，三倍体才显示出生长优势。 （三）其他性状

经过对鱼肉质量、含氧量、抗病性和感觉特性等性状的研究，发现三倍体虹鳟的鱼肉质量由于二倍体。三倍体香鱼的抗病力与二倍体无明显差异。

多数情况下，三倍体的个体不比二倍体大，这必然伴随三倍体个体细胞数量的减少，同时也伴随各个器官细胞数量的减少。脑细胞数量的减少导致三倍体的治理可能比二倍体低下，这有可能使三倍体的竞争力低。

第六节 多倍体的应用

（一）提高生长速度 （二）控制过度繁殖 （三）延长寿命 （四）改善品质

第七节 多倍体育种实例

（一）鱼类多倍体育种实例 （二）贝类多倍体育种实例

第七章 细胞融合与核移植

第一节 细胞融合 一、细胞融合的方法

两种不同细胞的混合物，自发发生细胞融合的频率非常低，所以一般需要添加融合剂或使用点融合计数，认为促进细胞的融合。 （一）病毒融合

利用病毒诱导此包融合的方法最早被采用，其中最有效而又最常用的是仙台病毒（HVJ）。 HVJ是具有囊膜的病毒，对人没有致病性。该病毒能强力吸附于细胞表面，因而HVJ为介导两细胞间可以形成甲壳，部分细胞膜一时破解，两个细胞融合。 （二）化学融合

化学融合是在20实际70年代才开始研究和使用的，其中使用最广泛的是聚乙二醇（PEG）。 PEG早期使用植物细胞融合细胞的融合试验中，现在各种各样的动物细胞也都普遍使用。 PEG通过去除细胞内的水分，作用于细胞膜，引发细胞融合。 （三）电融合

⏹ 电融合技术是利用交流非均匀电场使液体中浮游细胞沿电力线排列成串，形成待融合细胞之间的紧密接触，然后采用直流脉冲使细胞在相互接触部分进行细胞膜融合。 （四）激光融合

激光融合是利用激光微束破坏相邻细胞的接触区，从而诱导细胞融合的方法。 二、融合细胞的筛选

在随A、B两种细胞的融合中，可能会形成AA、BB和AB3种融合，而实际所需要的是AB融合体的方法有多种，下面介绍几种代表性的方法。

（一）荧光标记筛选

（二）形态、生化或遗传标记筛选 （三）选择培养基筛选 三、细胞融合技术的应用 （一）单克隆抗体的生产 （二）微生物育种 （三）植物育种 （四）动物育种 （五）基因定位 （六）生产活性蛋白质

第二节 核移植

细胞核移植是应用惊喜的显微操作技术，将一种动物的一个二倍体细胞核移植到同种或异种动物的去核（或核已灭活）卵母细胞（或受精卵）胞质中，在一定条件下，它能像受精卵一样、分化、发育形成胚胎、幼体或成体技术。 一、鱼类的细胞核移植

在鱼类细胞核移植研究方面，我国学者做了许多工作，处于国际领先地位。1963年童弟周等首次将细胞核移植技术应用到硬骨鱼类，把金鱼和鳑鲏的囊配细胞核分别移入同种鱼的去核未受精卵内，成功获得正常的胚胎和幼鱼。此后的40年时间里，有关鱼类细胞核移植的报到主要集中在我国，国外只有5篇。 二、核移植的方法

细胞核移植技术操作主要包括核供体鱼细胞质受体的制备、移核和核质杂种的培养4个步骤。

（一）核供体细胞的准备

核供体的细胞来源于囊胚期细胞和体细胞。 （二）受体卵细胞的制备

鱼类细胞质受体为成熟的未受精卵细胞，通常采用人工催产的方法获得。去核的方法主要有挑核法和功能性去核。 （三）移核

移核是在显微操作仪上将供体核卵母细胞的过程，是核移植工作种最惊喜也是最困难的部分。 （四）核质杂种的培养

移核后，一般将移核卵转移到Holtfreter液中，在适宜温度下培养至2~4细胞期，然后转入1/2浓度的Holtfreter液中，发育至原肠胚后，换入暴气水培养。 三、核移植技术的应用 （一）培育优良品种 （二）复制优良个体 （三）保护濒危、珍稀动物 （四）诱导雄核发育二倍体 （五）基础研究

首先，利用核移植技术研究胚胎发育过程中，细胞质和细胞核的功能，以及两只之间的相互关系。

其次，研究细胞核发育的全能性

再次，细胞核移植技术和基因打靶技术、胚胎干细胞技术相结合，可以提高转基因动物的生产效率，在研究基因功能上有重要作用。

总之，核移植技术具有重大的生物学意义，特别是体细胞核移植技术的成功表明动物分化的体细胞核可在程序化。 第八章 性别控制

第一节 性别控制的意义

水产动物性别控制的意义有以下几点： 1、提高群体生长率 2、控制繁殖速度

3、延长有效生长期 4、提高产品质量 5、提高性产品的产量

第二节 水产动物的性别决定与性分化 一、原始生殖细胞起源、迁移和分化 （一）原始生殖细胞的起源

原始生殖细胞（PGC）起源于生殖嵴本身的生殖上皮细胞的增殖作用。生殖嵴是性腺的前身，起源于中胚层，在胚胎时期背系膜两侧的体腔壁产生一对上皮纵褶，此纵褶称为生殖嵴或生殖摺。 （二）原始生殖细胞的迁移和分化

脊椎动物原始生殖细胞的迁移方式现在一般认为有4种形式：①通过原始生殖细胞自身的变形虫运动而主动迁移；②通过原始生殖细胞周围组织细胞的分化生长运动推动原始生殖细胞被动迁移；③通过血液循环运动的被动迁移；④化学动力迁移。即在将来形成生殖腺部位组织的诱导下，原生殖细胞被吸引过去。

（三）生殖嵴的发生和分化

个体发生过程中，生殖嵴的形成对性别分化起着重要作用。在两栖类和其他高等脊椎动物中，未分化的生殖嵴原基由皮质和髓质两种类型的体细胞组成，前者由腹膜壁衍生而来，后者由中肾芽基衍生而来。 二、生理性别

动物性别包括两个方面，一时由其生理构成所表现出的性别，称为生理性别；另一方面则为动物决定性别的遗传基础，称为遗传性别。生理性别是性别的外在表现，是遗传性别与环境互相作用的结果，而遗传性别则为有父母遗传下来的决定性别的遗传基础。 水产动物生理性别的分类： 三、遗传性别

在遗传性别中，与其他各种动物一样，性别决定的基础是遗传基因，不同的是在许多鱼类，决定性别的基因并不明显地集中性别性染色体上，常染色体上的

基因也参与到性别决定中。并且在发育早期，鱼类的性别更明显地表现出双向潜力：某些外部环境因素能在不同程度上影响鱼类的性别分化，从而使鱼类性别决定机制显得更加复杂。

遗传性别是受精时来自卵细胞以及来自精子的染色体相互结合而决定的。 （一）性染色体的主要决定类型 1、XX-XY型 2、XX-XO型 3、ZW-ZZ型 4、ZO-ZZ型 5、ZO-ZZ型

6、X1X1X2X2-X1X2Y型 （二）鱼类型染色体

H-Y抗原是异配性别动物细胞膜的组成成分，控制该抗原产生的基因由靠近Y染色体断臂着丝点（可能含有激活基因）、Xp远端区（可能含有抑制基因）及常染色体上的结构基因组成；雌雄性都可能含有结构基因，但在哺乳动物中，只有具有XY染色体的正常雄性个体才具有激活基因。 （三）鱼类性染色体与性别决定

位于常染色体上的基因也可能参与鱼类性别决定。其证据有 ：（1 ）不同的雌性（雄性）与同一雄性（雌性）交配，得到不同性比的后裔；（2 ）种间杂交得到不同的性比；（3 ）环境因子对鱼类性比的影响。（4 ）分子生物学证据。 （四）与性别决定有关的基因

与鱼类性别决定有关的基因有Sox基因，细胞色素p450芳化酶基因，DMY基因等。

四、鱼类的性转变

（一）鱼类的性黄转变现象

性逆转是指雌雄异体的动物有一种性别（雌或雄）向另一性别（雄或雌）转变的过程。性逆转的结果是动物体性别完全转变。性逆转现象有两种可能：一是生理性的，是生命过程的一部分；二是病理性的，个体体内的生理发生病态的变化导致极体内急速的紊乱而导致性别转换。 （二）影响性别转化的因素 1、激素与性转变 2、环境与性转变 3、性别转变机制

Shapiro（1988）提出性别转变中可能寻在两种机制，即去抑制机制和刺激机制。

第三节 鱼类性别的人工控制

性别控制是通过人工处理改变水产动物遗传性别所主导的发育方向，使个体或群体的性别按照人类设计的方向发展，进而形成的群体为单一性别或群体处于不育状态的方法。 一、单性群体诱导 （一）种间杂交

当雄性异配的雌性与雌性异配的雄性杂交时，得到的后代全部为异型配子合子。这样的异型配子合子的性别在所有杂交后代中是一致的，为同一的雄性。 （二）人工诱导雌核（雄核）发育

水产动物的配子，形成单倍体胚胎后让然具有完成胚胎发育的能力。根据之一原理，利用物理的方法或化学的方法使精子遗传失活，然后与成熟卵受精，精子只能起到激活卵的作用，不参与发育，卵的发育完全是在雌核的控制下进行的，这就是诱导雌核发育。

人工诱导星河发育的原理与人工诱导雌核发育相同。

（三）激素诱导

在生理环境中，类固醇激素是各种生理现象的诱导者。目前已经证实，类固醇激素可以影响多种鱼类及五脊椎动物的性腺分化。

1、激素诱导方法通常有4类：口服法、浸泡法、注射法和埋植法。 2、诱导剂量

不同的浓度的雌性激素和雄性激素对不同鱼类具有不同的生物学效应，通常有三个剂量级：低剂量、中剂量、高剂量。 3、外源激素作用的机理

性转变是一个复杂的生理过程，性激素如何影响性别决定方向，其作用机理是什么，虽然研究者众多，但目前还没有建立有说服力的理论。 4、石斑鱼性转变的细胞学 5、激素诱导鱼类性转变的实践

（四）我国科学家杨永铨等（1980）提出并建立了“三系配套法”。这三系分别是：

（1）原系：指自然群体中未经转化的雌、雄鱼，即XX ♀ 、XY♂。

（2）转化系 （ XY ♀ ）：遗传型雄鱼用雌激素诱导性转化后的表型雌鱼，即雌

性化雄鱼，用XY ♀表示； （3）雄性纯合系（YY ♂ ）：指性染色体未YY的雄性个体。 在生产中制药将雄性纯合系和原系交配就可得到全雄性后代：

XX ♀（原系）× YY ♂（雄性纯合系） XY♂

此外，若用雌性激素将一部分雄性纯合系YY ♂ 超雄鱼再转化为雌鱼，二者相互交配，就可获得100% 的超雄鱼： YY ♂ × YY ♀ YY ♂

三系配套法已在生产中应用，但它工作量大，种质资源要求高，时间长等缺点也了进一步推广。

（五）同配精子受精（精子分离）

精子分离的主要方法和技术如下：

（1）根据两类精子在重量、密度上的不同应用沉淀法进行精子分离 （2）根据膜电荷的差异应用电泳的方法分离异型精子 （3）依据异型精子密度的不同用密度梯度离心法进行分离 （4）应用免疫学方法分离精子

（5）依据两类精子DNA含量上的差别用流式细胞分类器分离X精子和Y精子。

二、鱼类不育技术

控制鱼类性腺不发育的方法有以下几种： 1、杂交

杂交，尤其是远缘杂交容易产生不育后代。 2、激素阉割

适当剂量和种类的类固醇激素可诱导鱼类发生性转变，但较高剂量的性类固醇激素却可以抑制性腺发育，得到性腺发育受到抑制的不育鱼，这就是激素阉割。

3、人工三倍体诱导

人工三倍体水产动物的最大特点是其不育性，即性腺不发育或发育不完善。 4、自身免疫阉割

自身免疫阉割又称为自身免疫性腺毁灭。这是通过自身免疫技术对水产动物进行阉割的方法，它可使鱼类或其他水产动物市区生殖技能以促进生长。 5、外科手术阉割

采用外科手术，摘除性腺，终止原来的生理性别，即所谓的手术去势。

第四节 其他水产动物的性别决定、性转变及人工控制

一、贝类的性别及性转变现象 （一）贝类的性别

软体动物门的腹足纲中有雌雄同体和雌雄异体种类，并且具有性转变现象。瓣鳃纲亦有雌雄异体和雌雄同体之分，但有不少种类，这种区分界限并不明显。头足纲是雌雄异体，而且两性异形，雌雄间差异显著。 （二）贝类的性转变现象

贝类中，雌雄异体的种类会发生性转变，雌雄同体种类也可以出现雌雄异体现象。

二、贝类的性别决定

对贝类进行性别控制的研究较少，尚未有关于激素诱导性别转变的研究报道，亦有的研究主要集中于多倍体诱导生产不育群体。贝类多倍体具有生长快，肉体大，闭壳肌大，成体成活率高和不育等优良性状。 三、甲壳动物（虾蟹类）的性别决定机制及其性转变

虾蟹类的性别是由内因和外因两方面因素决定的。内因是生物体的性别遗传物质，即性染色体或性基因；外因就是影响性别分化的环境因素。此外，甲壳动物所特有的内分泌腺——促雄性腺对性别决定也有举足轻重的作用。 （一）性染色体

甲壳动物各群体中有异型性染色体共49个物种，包括XX-XY型、XX-XO型、ZW-ZZ型或ZO-ZZ型。 （二）促雄性腺

促雄性腺又叫雄性腺，是甲壳动物特有的内分泌腺，其分泌的促雄激素，具有诱导甲壳动物性别分化、促精子及第二性征形成的作用。。 促雄性腺对甲壳动物雄性初级、次级性征发育和维持有重要作用。

促雄性腺影响甲壳动物性别的机制是目前较认同的是吴仲庆和Ginsburger-Vogel等提出的假设：即一对同源染色体上的等位基因（）控制这些动物的性别，雌性为影星纯合体m/m或mm，雄性为显性杂合体M/m或Mm，M-m决定促雄性腺的有无或显隐性，M对m为显性。当基因型为Mm时促雄腺发育，表现为显性，个体为雄性。当基因型为mm时，促雄腺不发育，表现为隐性，个体为雌性。

（三）环境因素

虾蟹类由于在进化上的原始性，性别决定的遗传力明显小于高等脊椎动物，其性别更易受到外界环境的影响，且容易发生逆转。

在各种外部环境因素中，温度、食物丰度、光照、盐度和水质都可能影响虾蟹类的性别及其分化。 （四）分子生物学证据

利用分子标记寻找性别特意片段的研究取得了一些成果。应用在高等机制动物中性别特异性探针如SRY、ZFY、Bkm、DMY和DMRT1来寻找虾蟹类的同源基因也是一种便捷手段。 四、甲壳动物的性别控制方法

甲壳动物的促雄腺和卵巢产生的性激素能使异性性反转或抑制异性性征发育，实践中可以通过切除或移植促雄腺以及移植卵巢等手段进行性别控制。用性激素控制性别的研究在很多动物中均取得了成功。

第九章 转基因技术

第一节 概述

（一）转基因技术的发展

自从1953年Waston和Crick提出双螺旋结构以来，生物科学取得了突飞猛进的发展，并从细胞水平进入了分子水平。到20试剂70年代末期，人们已能够成功地用微生物来生产人的胰岛素和干扰素等医药产品。1982年，美国科学家将大树的生长激素基因转入小鼠体内培育出具有大树雄健体魄的转基因小鼠及其子代，标志着人们已可将单一功能的基因或校型基因移入高等动物的染色体DNA上，构建出理想的转基因动物。

转基因通常是指在DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因。

（二）转基因技术在水产动物育种中的应用 转基因技术与传统育种技术有两点重要区别：

首先，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选额，对后代的表现预见性差，选出优良性状的概率基地。而转基因技术则能克服传统育种的不足。

其次，传统育种技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移，血缘关系较远的生物之间通过传统杂交而进行的基因转移难度则非常大。而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的，可以有效避免种间，属间，甚至动植物近物种杂交的不亲和性。

转基因技术在水产动物育种中的应用主要体现在以下几个方面： 第一，改良养殖性能； 第二，生产医药生物制品；

第三，培育新型观赏鱼或其他用途。

鱼类转基因工作在我国开展的较早。朱作言（1985）首先进行鱼类转基因研究。随后，许多关于转基因鱼的研究工作相继开展起来，人、牛和羊生长激素基因分别作为外源目的基因被用于转基因研究。

第二节 转基因技术的原理与方法

移植到受体中的外源基因，其结构一般包括3个部分：启动子、目的基因和转录终止信号。 一、启动子

启动子是DNA分子结构RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，它和增强子（增强转录活性的结构）一起构成了基因转录的顺式作用元件。没有启动子的存在，外源基因就有可能不被转录进而不能表达。选择恰当的启动子是保证外源基因在转基因在转基因水产动物中成功表达的重要因素。在转基因水产动物中，成功的启动子应当知道外源基因在适当的时间、特定的组织中进行表达，且表达的量要求达到一定程度。

目前在转基因鱼研究中，使用的启动子可归为以下3类： 1、来自高等动物病毒基因的启动子； 2、来自高等动物的启动子和增强子； 3、来自鱼类基因的启动子。 二、目的基因

1、选择目的基因的原则

目的基因的选择对于构建理想的转基因水产动物来说是至关重要的。目的基因是指编码特定蛋白质的结构基因，它的表达能使转基因水产动物产生新的表型。根据转基因水产动物的潜在价值，目的基因的选择应遵循以下原则： （1）改变受体的代谢特征； （2）改变受体对环境适应能力。 2、常用目的基因

当前在水产动物中转移的目的基因主要有以下几种： （1）生长激素基因 （2）增强抗逆性的基因 （3）报告基因 三、外源基因的导入

外源基因构建好以后，接下去的任务就是将外源基因转移到受体水产动物中。将外源基因导入动物受体细胞有多种方法，主要有显微注射法，电穿孔法，精子载体法，逆转录病毒转然法、基因法、磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法、激光介导法等

（一）鱼类基因转移中外源基因的导入方法 1、显微注射法

显微注射法是借助于显微镜的放大技术，直接把外源基因注射到动物的卵母细胞、受精卵、早期胚胎、胚胎肝细胞或体细胞中，然后生产动物个体的方法。在某些情况下，显微注射前需要先对鱼卵进行处理，如对对鱼卵离心以便使胚泡处在卵的顶部，用荧光染料染核以及用酶或镊子去掉卵壳，采用这些措施是为了方便显微注射。 2、电穿孔法

电穿孔法又叫电脉冲法，其基本原理是利用外部高压短脉冲使细胞膜的结构改变，使之产生可逆的孔隙或孔洞，一定大小的分子包括DNA即可通过孔隙或孔洞进入细胞。

优点：操作简便，可同时处理大量的受精卵，特别适用于那些容易获得大批量受精卵的动物。

缺点：导入是随机的，无定向性，且转移率较低，需这对不同种鱼建立相应的电脉冲条件。 3、精子载体法

精子载体法又叫精子携带法，是以精子作为外源基因的载体，通过人工受精将外源基因导入动物胚胎，从而将外源基因带入子代的基因组中而实现基因转移。

优点：简便，成本低廉，便于大量筛选、相对温和等。

精子载体法主要有3种方式：直接混合法、脂质体法、电穿孔法。 4、基因法

基因法又叫告诉钨微粒轰击法或粒子法，是通过把吸附DNA的金属微粒高速打入受体细胞内，从而使外源基因导入受体细胞内的方法。该方法特别适合于细胞壁厚的植物细胞，在鱼类中也有成功的报道。 优点：可以短期内处理多个个体。

缺点：在外源基因的稳定性和表达方面存在问题。这以技术目前在水产动物转基因研究和应用还有一定难度。 5、逆转录病毒感染法

逆转录病毒是RNA病毒的一种，进入宿主后从RNA逆转录成DNA，并结合到病毒染色体上，因而宿主细胞染色体内就存在有病毒基因。如果把目的基因组合到病毒染色体上，用改造的病毒请然宿主细胞就有可能向细胞内导入外源基因。

此法对鱼类不太适用。 6、组织注射法

外源基因向机体组织直接注射时，周围细胞能将外源基因纳入，并且注射的外源基因被整合。

（二）虾类基因转移中外源基因的导入方法

转基因虾的研究由于其繁殖生物学和发育生物学的特殊性，至今仍是一大难题。目前对于转基因虾的研究最迫切需要解决的问题就是外源基因的导入方法。

显微注射技术很难应用于中国对虾和对虾相似繁殖方式的甲壳类动物。精子携带法由于虾特殊的繁殖发育特性而受到极大。

有人将基因法引入虾类的转基因操作中，取得了令人鼓舞的结果。

第三节 外源基因的整合、表达与遗传

一、外源基因的整合 （一）外源基因的命运

外源基因导入受精卵后，经历了一系列复杂的生物学过程，一般在胚胎发育早期的受体细胞内进行大量的复制，复制以后经历部分讲解、变构、多聚化和逐渐与基因组整合的过程。

外源基因在染色体中整合位点的差异对其表达及转基因鱼胚胎产生不同影响，拜偶像为3种整合方式：有效整合、无效整合或沉默表达、毒性整合。 （二）随机整合

1、外源DNA整合的构型

在多数情况下，外源基因以串状多拷贝的头尾相连的构型整合到染色体的一个位点，极少请款下为头对头或尾对尾的方式。其特点为：

（1）一个特定的胚胎或一个特定细胞克隆，DNA总是整合在染色体的单一位

点，最多整合在少数几个位点上。 （2）在每一个整合位点，外源DNA通常呈现多拷贝串状整合。

（3）在绝大多数情况下，某一位点上多个、拷贝串状整合的外源基因，采取头

尾相连的排列方式。 （4）在极少情况下，可发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连接方式。 2、外源DNA整合到染色体上的机制

外源DNA通常都插入染色体的一个位点，在少数情况下插入一个以上位点，甚至插入不同染色体。一般认为，外源DNA与其染色体上整合位点之间，存在低度同源性；一种带有小卫星序列的基因常会整合到染色体的卫星序列中。上述两种情况说明，整合常发生匹配较差的序列之间的不正常交换。 3、外源DNA整合时间和转基因嵌合体产生

嵌合体动物是由至少两种基因组结构不相同的细胞类型构成的动物个体。转基因嵌合体动物的身体是由转基因的和非转基因的两种细胞所组成。转基因嵌合体的产生是由于近缘整合时染色体已复制，或者已整合的基因从一个子染色体上丢失。

4、整合效率

外源DNA复制量与注入外源基因拷贝数在一定范围内（105~107个/卵）成正相关，与线性DNA分子片段长短也有关，线性外源DNA的最大扩增数可达100倍以上。

外源基因的整合率与受体鱼种类、注入方式、注入DNA的构型以及剂量有关。 （三）同源重组

双链DNA两个区段的序列基本一样，但不一定完全相同，叫做同源区。DNA通过同源奇偶啊换整合到染色体上的机制，为向目标基因导入预先设计的突变提供了途径，这种方法包括基因楔入和基因剔除，通常被称为基因打靶。 1、基因楔入又称基因置转技术，使双链的断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列之外，转基因的结果是外源DNA取代内源靶序列。

2、基因剔除是基因打靶的一种方法，类似于同源重组技术，特指外源DNA与受体细胞中同源基因组合并取而代之。 二、外源基因的表达

（一）基因的表达及其机制

1、组织特异表达组织特异表达是通过两种机制实现的：第一种是相对短的过程，由于出现在表达细胞内的因子结合到基因的DNA序列上，激活基因表达。第二种过程是长效，使细胞永久性地处于分化转台，每一种细胞都可以长期维持和记忆它所属的细胞类型的特征，只表达它应当表达的基因。

2、染色质的结构

线状DNA分子长度很长，但在细胞中是和特殊的核蛋白一起折叠和紧缩为一种称为染色质的结构。染色质的基本结构单元是核小体，由于约200个剪辑对长度的DNA和组单被八聚体结合而成。细胞中形成3类不同包装水平的染色质结构：大多数不活动的DNA形成高度卷曲和包装的螺线管结构；活跃的和潜在活跃的基因形成更加开放的串珠状结构；而在基因的某些区段则形成没有核小体的裸露DNA或结构上变得松散的核小体。 （二）真核基因的表达过程

真核基因的表达过程比较复杂。当转移的外源基因插入到染色体的某一位点时，它除了受到自身携带的表达元件的制约外，还要受到所处的染色体环境的影响。

（三）外源基因的表达

由于外源基因在亲本的整合发生于第一次卵裂之后，并可能整合于不同位点。 大量的试验结果证明，外源基因在受体中表达未定性差。

许多转基因构建的表达受其在宿主染色体整合位点的强烈影响，这种现象称之为位置效应。这种效应的存在使得研究者们难以确定转基因的表达频率和表达水平。

（四）表达结构的构建和功能域转移

由于多数基因的基因控制区和远端增强子尚未分离出来，在构建用于生产转基因动物的表达结构时，一般都是在目的基因的两端各增加一个1~5kb的DNA片段，大概只有含有启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。

若要可靠和有效表达目的基因，必须构建和转移完整的功能区域，使被转移的基因表达结构包含一切必要的元件，以便实现不依赖整合位点的有效表达。

三、整合基因的遗传

由于转基因动物的特殊性，关于外源基因的遗传问题，已经掌握的研究结果非常有限，由此不能完全清楚外源基因的遗传规律。主要原因是转基因动物中嵌合体的比倒较高，繁殖过程中外源基因向子代的传递表现出无规律性。 转基因鱼所携带的外源基因可以通过性腺传递到子代，但子代鱼个体间外源基因的拷贝数存在很大差异，认为是外源基因多位点整合和嵌合性整合的缘故。

第四节 外源基因的检测

外源基因导入受体水产动物后，通常发生外源基因进入到核中或者没有进入核中等两种情况。进入核中又存在下面几种情况： 第一种是外源基因游离于核染色体之外； 第二种是部分同源序列插入核DNA中；

第三种是外源基因全部插入核DNA中。 一、外源基因导入的检测

为了方便外源基因整合于表达的检测，减少检测动物的数量，通常用斑点杂交和PCR技术对受体动物进行初步筛选，以期确定受体动物是否导入了外源基因。

（一）斑点杂交

指将被检标本的DNA点到支持膜上，烘烤固定。一张膜上可检测多个样品。其过程如下：

（1）先将膜在水中浸湿，在放到15×SSC中；

（2）将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷；

（3）用铅笔在滤膜上标号位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5微升（2~5微克DNA）；

（4）将膜烘干，密封保存备用。

（5）以同位素或荧光标记的外源基因部分片段作为探针，进行杂交检测，通过阳性结果初步确定含外源基因的受体动物。 （二）PCR阳性检测

PCR即多聚酶链式反应，这种检测方法是先根据导入的外源基因设计特异的检测引物，然后提取转基因水产动物的基因组DNA，再对转基因水产动物的基因组DNA进行PCR扩增，电泳后根据带型判断PCR产物的大小。如果扩增条带大小与外源基因大小一致则可确定检测对象含有外源目的基因。 二、外源基因整合的检测

提取样品基因组DNA，运用Southern杂交技术，以导入的外源基因作为探针，与基因组DNA做分子杂交，经放射自显影，就可鉴定外源基因是否整合到基因组内。

（一）外源基因整合的判断

外源基因在受体水产动物中整合部位是随机的，且通常为首尾相连的多拷贝。当选择在外源基因片段中仅有单切点的性内切酶对受体水产动物DNA进行酶切时， Southern杂交产生的阳性带大小如果与注射入受体的外源基因大小一样，则表明外源基因已经整合入受体水产动物基因组。 （二）非整合形式的外源基因的判断

当注射入受体的外源基因呈游离状态存在时，如果用单切点内切酶进行Southern杂交检测，就没有与外源基因片段大小一致的阳性带，而出现两条较小的阳性带。在整合了外源基因的受体水产动物样品中，有时也肯弄个出现这两条较小的阳性带，但杂交信号较弱，这是由于受体中同时含有整合及非整合外源基因的结果。

三、外源基因表达产物的检测

外源基因的表达包括转录和翻译两个阶段。

外源基因表达产物的检测过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。 （一）特异性mRNA的检测

利用Northern杂交技术可以检测外源基因是否转录出mRNA。其过程如下： （1）提取总RNA； （2）分离mRNA； （3）制备RNA探针； （4） Northern杂交。 （二）报告基因的酶法检测

报告基因具有两大特点：其一是表达产物及其功能在为转化的受体细胞中不存在；其二是报告基因的表达产物便于检测。目前在动物细胞基因工程中使用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因，β-葡萄糖苷酸酶基因，胸苷集美基因，二氢叶酸还原酶基因等。荧光素酶基因检测是一种简便、灵敏的检测方法。其检测方法主要有两种：一种是活体内荧光素酶活性检测；另一种方法是体外荧光素酶活性检测。

（三）免疫学检测

免疫学方法检测是基因表达产物检测中最常用的方法之一。对特定基因表达产物的免疫学检测包括免疫沉淀法、酶联免疫吸附法、Western印迹杂交法和固相放射免疫法等。 1、免疫沉淀法

优点：选择性好，灵敏度高，并可从蛋白质混合物中提纯出抗原-抗体复合物。 步骤：

（1）对靶细胞进行放射性标记 （2）细胞裂解

（3）形成特异性免疫复合物 （4）靶蛋白的免疫沉淀

（5）蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 2、酶联免疫吸附试验 步骤： （1）抗备

（2）抗体或抗原的包被 （3）免疫反应

（4）特异表达产物的检测 3、 Western印迹法 步骤：

（1）总蛋白质的提取

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 （3）蛋白质印迹 （4）探针制备

（5）杂交和检出

4、固相放射免疫（RIA）法等。 根据实验方法的不同可分为4类： （1）竞争性RIA （2）固定抗原RIA （3）固定抗体RIA （4）双抗体RIA

（四）表达产物生物学活性检测

当外源基因的表达参悟是一种酶蛋白质，可根据酶的催化反应来确定基因表达与否和表达的程度。

第五节 转基因水产动物的安全性 一、转基因水产动物的使用安全性

转基因动物及有转基因动物生产的食品安全某种程度上受外源基因的种类所左右。目前转基因动物使用的外源基因的表达产物多为激素类或酶类等蛋白质，一般是无毒的。表达的产物对人体无毒副作用或不利影响，但也不排除有些激素类表达产物可能对人体有一定的作用，所以转基因动物的食品安全荧光受到重视。

二、转基因水产动物的生态安全性

转基因水产动物进入自然水域生态系统会对其产生什么样的影响是值得人类共同关注的大问题。从生态安全角度考虑，任何人工物种的引入应当以不干扰水生生态系统的演替进程、不破坏水生生态系统的生物多样性和遗传多样性为前提。转基因水产动物作为人工遗传修饰的个体在环境释放后，可能与野生中交配，导致外源基因扩散，改变物种原来的基因组成，造成种质资源的混乱。 第十章 育种实践中的标记技术 第一节 遗传标记概述

遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征，它是育种学研究的主要技术指标之一。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。

从遗传学的建立，遗传标记的发展主要镜鲤的4个阶段，表现出4种类型：形态学标记，细胞遗传学标记，生化遗传学标记和分子遗传学标记。 （一）形态学标记

形态学标记是指生物的外部特征特性，包括质量性状和数量性状，主要包括肉眼可见的外部形态特征以及生理特征、生殖特征等。 优点：易于识别和掌握、简单直观等

缺点：标记数量少、多态性差和易受环境影响等。 （二）细胞遗传学标记

染色体核型和带型可以作为遗传标记，用来测定基因所在的染色体及现对位置，也可通过染色体置换等进行基因定位。染色体族姓和带型通称为细胞遗传学标记。

染色体组型：指生物体细胞所有可测定的染色体特征总称，包括染色体总数，染色体组数，每条染色体大小和形态、着丝粒的位置等。

带型：是用如你所提粉黛技术所产生的明显的染色体带（暗带）和未染色大的明带相间的带纹，使染色体呈现鲜明的个体性，如C带，N带，G带等。 （三）生化遗传标记

1941年，Beald和Tatum通过研究红色面包酶的生化突变型，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学，这也是第一将生化遗传标记标记用于遗传多样性分析的实例。Smithies于1955年用淀粉名叫电泳分离血清蛋白成功，生化遗传学标记因而得以迅速发展。

生化遗传学标记是指生物的生化特征、特性，是以基因表达产物——蛋白质为基础的标记，主要包括血型标记、血清蛋白标记、同工酶和等位酶标记。 （四）分子遗传学标记

分子遗传学标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。

特点：

（1）直接一DNA的形式表现，不受环境影响，不受基因表达与否的，可对各个时期的个体、器官、组织、细胞等做检测。 （2）数量多，编辑整个基因组，检测位点几乎无限

（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无需创造专门的特殊材料

（4）多数分子遗传学标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息；

（5）表现为“中性”，即不影响生物性状的表达。 第二节 分子遗传学标记的类型及原理

根据遗传学标记产生的特点，通常将其分为若干种类：第一类是以分子杂交技术为基础的分子遗传学标记。第二类是以PCR为基础的分子遗传学标记。 一、性片段长度多态性

性片段长度多态性是出现最早、用用最广泛的一种分子遗传学标记。RFLP是指性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。 （一）PFLP标记的原理

PFLP的产生主要是由于基因组DNA序列上的变化。 PFLP的基本原理是利用性内切酶对特定生物类型的基因组DNA片段进行酶切，产生数百万条DNA片段，通过电泳将这些不同长度的酶切DNA片段分离开来，然后将它们按原来的顺序和位置转移到支持膜（尼龙膜或纤维素膜上），用放射性同位素或非放射性物质标记后的DNA片段作为探针，与膜上的DNA酶切片段进行杂交。若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合于这个位置上，后经放射自显影或酶学检验，即可显示出与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异。 （二） PFLP标记的特点

优点 ：（1 ）无表型效应；（2 ） PFLP标记有共显性的特点，因而配置杂交组合时不受杂交方式的影响；（3） PFLP标记具有种族特异性，它对于分析一个分离群体的不同来源的染色体片段具有重要价值。（4） PFLP标记遍及全基因组，因而它已被广泛使用于有益基因的分子遗传学标记定位，数量性状微笑基因的质量化，以及用于杂种优势理论的探讨和有效预测；（5） PFLP标记还具有重复性好，稳定性高的优点。 二、随机扩增多态性

随机扩增多态性DNA技术是1990年由Williams等人首先提出的，它是建立在DNA聚合酶链式反应基础上的一种DNA分子遗传学标记技术。PAPD标记是指用人工随机合成寡聚脱氧核苷酸作为引物通过PCR扩增基因组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。 （一） PAPD标记的原理

PAPD与RFLP的不同之处在于RAPD分析中显示多态性的片段不是由性内切酶酶切基因组DNA产生的,而是通过PCR反应扩增基因组DNA模板产生的。

（二） PAPD标记的特点

优点 ：（1 ）具有极大的丰富性；（2 ）极强的探测性；

（3 ）高效性与灵敏性； （4 ） PAPD技术简便易操作； （5）所需要样品量少。

缺点 ：（1 ）稳定性低；（2 ） PAPD标记一般表现为显性遗传；

（3）高度的变异性。

三、扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性是由Zabeau marc和Vos pieter在1993年发明一种DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示性酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。

（一）AFLP标记的原理 AFLP标记技术的三个步骤：

（1）DNA的准备、酶切以及人工合成的寡聚核苷酸接头连接； （2）酶切片段的预扩增和选择性扩增； （3）扩增的酶切片段的电泳分离与检测。 （二） AFLP标记的特点

优点 ：（1 ） AFLP可以产生的标记数量几乎无限；（2） AFLP揭示出的多态性程度极高；（3） AFLP标记具有显性或共显性表达；（4）无物种特异性；（5）因PCR扩增时所用退火温度高，所以该标记稳定性和重复性高；（6）模板用量少；（7） AFLP分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，可用于分析基因组DNA及克隆相应的DNA片段，可作为遗传图谱和物理图谱的位标和联系二者的桥梁。 四、简单重复序列

简单重复序列又称微卫星DNA标记。它产生的原因主要有 ：（1 ）DNA 复制过程中的滑动；（2 ）DNA 复制和修复时滑动链与互补链碱基错配；（3 ）在减数中的不等交换，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，使这些重复序列的拷贝数发生了变化，从而形成群体内个体间的多样性即多态性。 （一）SSR标记的原理

尽管SSR分布于整个基因组的不同位置，但它两端的序列多是相对报送的但拷贝序列，因此可以根据连段的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析核心序列的长度多态性。 （二） SSR标记的特点 优点：

（1）数量几乎无限，分布于整个基因；

（2）SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；

（3） SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）结果重复性高，稳定可靠；

（5）兼具PCR反应的优点，即所需DNA样品量少，对DNA质量要求不苛刻。

五、简单序列重复间区的DNA序列

简单序列重复间区的DNA序列标记技术是由Zietkiewicz（1994）在SSR基础上提出的，检测的是基因组中两个SSR之间的一段短的DNA序列上的多态性。

（一）ISSR标记的原理

利用基因组中广泛存在的SSR序列，设计各种能够与SSR序列结合的PCR引物，对两个相聚较近、方向相反的SSR序列之间的区段扩增，然后通过电泳检测其扩增产物的多态性。 （二）ISSR标记的特点

特点： （1）ISSR标记呈典型的孟德尔式遗传，一般表现为显性或共显性；（2）可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行基因组指纹图谱构建；（3）可以同时检测基因组多个SSR座位；（4）在基因定位上，可以采取礌石RAPD的方法寻找与所定位基因相连接所的DNA标记；（5）可以在生长周期的任何阶段进行检测，且DNA用量少。 六、单链构象多态性 （一）SSCP标记的原理

SSCP技术是一种以DNA序列为基础的检测DNA链多态性的分析技术。自然状态下的单链DNA会折叠卷曲，形成一定的空间构象，其特性是由DNA链的特定碱基顺序。在SSCP分析中，利用pcr技术定点扩增出基因组DNA分子上的某一目的序列，然后将扩增产物进行变性处理，使得双链DNA分开成单链，再用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。如果被扩增的目的片段任意一条DNA链中碱基序列发生了变异，则可能会由于这种变异而引起构象的改变，进而影响在凝胶中的迁移率，因此能通过电泳分离，从而显示不同生物个体的DNA特异性。

（二）SSCP标记的特点 优点：

（1 ）原理简单，操作简便，技术容易掌握，实验步骤少，周期短； （2 ）灵敏度高；

（3 ）适合于大样本筛选；

（4 ）跟适宜于对功能基因进行研究。 七、单核苷酸多态性 （一）SNP标记的原理

单核苷酸多态性标记是指基因组序列单个核苷酸差异而引起的遗传多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入、缺失等。鉴定SNP的方法主要有 ：（1 ）在DNA 测序过程中通过碱基的峰高和面积的变化检测单个核苷酸的改变引起的DNA 的多态；（2 ）是通过对已有的DNA 序列的比较分析进行鉴定。 （二） SNP标记的特点 特点 ：

（1） SNP位点的丰富性； （2） SNP具有极高的信息量； （3） 可自动化操作。

八、各种DNA分子标记的综合比较 第三节 分子标记在育种中的应用 一、种群遗传结构分析

（一）在亲缘关系及系统发育中的应用 （二）在种质鉴定中的应用 （三）在遗传多样性上的应用 二、预测杂种优势

三、分子遗传图谱的构建与基因定位 四、分子遗传学标记辅助选择 第四节 人工标记 一、人工标记的意义

水产动物的特点是个体小、群体大、生长状态不便观察，具有流动性，通过个体的形态特征或以陆生动物的方法对个体进行形态标记难度较大。非标记个体进入养殖群体在同一水体中养殖几乎无法跟踪，由于养殖周期中生长带来的形态变化使得每一个个体进行识别难度较大。并且在育种实践中，进行同环境的对比试验时，不同试验个体或品系之间形态特征的相似性，给识别每一个个体带来了极大的困难，往往成为影响实验进行的因素。 二、人工形态标记

主要有剪鳍标记和烙印标记。 （一）剪鳍标记

对于人的肉眼而言，鱼体的一些器官形态是基本一致的。经过人工的处理以后即可形成形态的差异，利用这种差异进行人工标记是早期鱼类放流标记和同塘生长对照标记经常采用的方法。相对而言，鱼体的鳍条数量较多，有些鳍条的缺少对其生活力影响较小，故而通常采用剪鳍法来标记需要标记的个体。在育种过程中，为了在同样的环境条件下，对两个以上的群体进行生长对照，需要对两个以上的群体进行标记，通常采用剪鳍法。一般选择偶鳍作为标识可以使剪鳍对其生活力的影响一致。 （二）烙印标记

用加热（热烙）或冷烫（液氮冷烙）的方法在鱼体的某一部分去掉少量的组织形成疤痕（烙印）可以作为标记，使用有腐蚀作用的化学物质也可以达到同样的效果。烙印部位一般在鱼体背前侧，该位置操作简便，且识别容易。 激光标志是使用激光光源，诱导课题表面的化学反应或物理反应进行可使的技术，往往是在“灭菌”的情况下进行，不易引起损伤与感染。 三、化学物质标记

（一）荧光标记

荧光标记又称为可视植入发光硅胶标记，是将含有荧光物质的硅胶注射到鱼体皮下或其他动物的透明组织中，依靠荧光的发光作用产生的颜色效果对标记群体进行识别的方法。该方法依靠发光的颜色对不同的种类进行标识，也可以通过不同颜色的组合对个体进行标识。 （二）放射性同位素标记

通过饲料添加或注射的方法将半衰期长，构成鱼体组织的一个成分的同位素送入鱼体，通过专门的仪器即可对标记个体进行识别。该方法成本较高，但标记准确，因此使用于小规模、准确性要求高的实验。 四、标签标记 （一）拴签标记

在鱼体的表面挂上一个标签，制药挂的位置适当，标签牢固不脱落，则可以对所有的实验对象进行识别。挂牌或拴签的最大障碍是拴签的标签可能会萦系那个鱼体的正常活动，这就要求标签小而牢固不易脱落。 （二）埋签标记 1、数码棒

不锈钢加磁金属线上打印十进制数码作为标识的方法称为数码线标记，其标记的主题称为数码棒或数码线。该数码棒用激光打码，可以携带大量的信息；体积极小，长为1、1mm，直径为0.25mm；对标记生物几乎没有影响，而且不会丢失；标记个体易于探测，数据明了清晰。采用注射器式手动标记工具或自动标记工具可以大量的标记各种水产动物。

标记的解码需在专用显微读出仪上进行，这意味着被标记个体需要进行手术或杀死方能取出标记棒，对于需要存活进一步研究的试验动物则可以将标记棒植于不重要的器官之中，这样可以随时对标记个体进行识别，然后重新标记 2、可视植入签标记

可视植入签标记又称为可视式内置标记，是将带有荧光数码的标签植入到水产动物组织内进行标识并直接识别的方法。该方法需将标识的荧光签用类似于注射器的装置将标签植入到生物体的组织（皮下），由于植入的较浅，而且组织具有一定的透明度，因此可以在任何时候对标记的个体进行识别。因此该方法适用于对个体稍大一些的动物进行跟踪研究。

3、芯片标记

芯片标记是将携带大量信息的电子芯片驶入到鱼体内进行标记个体的技术。鱼体植入的芯片内以数字或代码形式记载所有与标记个体相关的信息，可以在任何时候通过电子数字读取器对个体进行扫描，读取器屏幕上即可显示标记个体上有着不同组合的数字或代码。 五、电子标记辅助育种

对个体进行标记并通过电子计算机辅助建立系谱，跟踪每一个个体是鱼类育种学的一项新技术。该技术可以对每一个个体进行标记和跟踪，因此可以掌握每一个选育对象的系谱，了解所有选育随想之间的血缘关系。运用这项技术不但可以消除由近交引起的遗传衰退，还可以通过人工选配提高选育个体的经济性能，达到每一代获得遗传改进的目的。

第十一章 繁育群体遗传性能的保护 第一节 品种的生产性能及其遗传基础

根据水产动物的繁殖方式、遗传基础、育成特点将水产动物的品种划分为以下3个类型： （一）群体品种

群体品种是指品种的繁育群体较大，以随机交配方式进行繁殖后代的品种，群体内多数个体的遗传基础具有杂合性。其特点为： （1）群体内个体的数量大

（2）自然繁殖时随机交配，群体的遗传基础比较复杂 （3）个体间的基因型不尽一致，杂合度高。 （二）杂交种

杂交种是指经严格筛选后配制的杂交优势组合的F1群体。由于其基因是高度杂合性的，群体表现出较强的生产性能优势。但杂交种不能稳定遗传，F2发生基因型的分离，性状整齐度较低，生产性能也严重降低。故此杂交种在生产上制利用F1。 （三）纯系品种

纯系品种是指生产上利用的遗传基础基本相同、基因型基本纯合的品种。这里的纯系是相对群体品种而言，绝对的纯系是不存在的。水产动物的纯系品种有两类：一类是近似于植物的无性生殖系，靠雌核发育或杂种发育繁殖的品种，雄性在其生殖过程中，遗传物质不起作用；又由于它们的减数机制特殊，决定了它们的群体遗传结构基本一致，群体保持极高的遗传同质性。另外一种类型实际上是高度近亲交配形成的近似于近亲交配系，由于群体的规模小不可避免的同胞或半胞交配，或人为的交配控制使其多代的近亲交配导致异质性在群体内遗失，形成高度纯合的基因型群体。 第二节 养殖条件下品种生产性能的退化

生产性能的衰退实际上表现在两个方面，即混杂和退化。 一、品种的混杂 （一）混杂现象

品种的混杂是指品种内具有了一些本品种不应该具有的基因或遗传物质，使得品种表现出非本品种固有的性状或性能，同时也降低了品种的生产性能。 混杂是一种普遍的现象，其危害十分严重。它主要表现是其他品种或品系与该品种的混合导致品种生产性能的不稳定，经济性状参差不齐。 （二）混杂的原因

品种混杂是一个十分严重问题，但其发生的原因起始很简单，即多品种的混合饲养与繁育，期间操作不慎导致的混杂。另一个重要的原因是各种水产动物之间的杂交，杂交种的无序管理和逃逸，进入繁育群体导致的混杂，逃逸到自然水体导致自然种的基因污染。 （三）品种混杂的预防与提纯

对于群体品种，尤其是大规模繁育的群体品种，最为有效的方法是隔离繁殖。 品种发生混杂在进行提纯的工作应该交由专门育种部门进行。提纯的原理和方法属于育种中选择育种的范畴，只有严格按照选择育种的方法进行提纯工作，品种才能够在保证不发生退化的前提下被提纯。 1、繁育亲本选择

在繁殖过程中对需要提纯品种的繁育亲本进行适当的选择，是那些有可能含有混杂基因的个体没有机会繁育后代，进而切断这些显性的混杂基因在品种内的传递，这个工作在日常繁育群体的管理中即可进行，也就是淘汰那些表现型不一致的个体。

2、剔除基因混杂个体

剔除基因混杂的个体也就是去杂除劣。去杂是指去掉具非亲本性状的个体，除劣则是去掉生长不良、弱小的个体，因为弱小个体可能是表现型变异，且携带异质基因，故去杂要彻底，除劣要谨慎。

一般情况下可以对需要进行提纯的品种加大选择力度，首先建立较大规模的后备亲鱼群体，然后对群体进行高强度的选择，淘汰那些混杂基因显性的个体，严格按照品种的标准进行一至两代高强度的选择，一般可以提纯该品种。 3、避免近亲交配

品种提纯易使人们联想到近亲交配，通过近亲交配可以很快的达到品种提纯的目的，但是由此提纯的品种同时有可能面临更加严重的退化问题，所以提纯中要注意避免过度的近亲繁育，避免进行个体选择或者以个体建立选育系，这样虽然纯化了品种，但同时又由于变异基因的大量丢失导致衰退的发生，得不偿失。

二、品种的退化

（一）品种退化的现象

人工养殖的水产动物多是群体品种，除了容易发生混杂现象以外，更容易发生品种的退化。与混杂相反，品种的退化是因为品种原先具有的异质基因流式导致生产性能衰退的现象。混杂是外来基因的侵入，退化品种固有基因的丢失，前者表现为群体性状的混乱，后者表现为群体性状的整齐划一，但生产性能衰退。

（二）品种退化的原因

在养殖条件下，引起养殖品种或养殖群体生长速度减慢、性成熟提前和其他生长性能衰退的原因很多。营养缺乏，养殖密度过大，严重的长期低溶解氧等环境胁迫等都可以引起生长性能的衰退，但大多数情况下是由于发育群体的异质性或遗传变异减少、种群遗传同质性增加而导致的生长衰退。

除了近亲交配以外，还有遗传瓶颈变异、遗传漂变等可以导致同质性增加、异质性降低。

第三节 群体的遗传变异与近亲交配衰退（退化）

群体的遗传变异是多种多样的，对生产性能产生较大影响，导致品种生产性能的衰退（退化）的主要是遗传瓶颈变异、遗传漂变和近亲交配衰退。 一、群体的遗传变异 （一）瓶颈变异

遗传瓶颈变异是指一个群体在数量上突然大量减少的现象。群体的数量变化就像一个大肚子的瓶子在瓶颈处突然缩小，大群体急剧变为小群体，使得小群体携带的基因变异的量在瓶颈处突然减少，因此称为瓶颈变异。 （二）遗传漂变

遗传漂变是指一个小的群体脱离远群体或与原群体发生生殖隔离几个世代后的遗传变异。由于该小群体与原始群体没有基因交流，且由于群体规模较小必然导致群体内某种程度的近亲交配发生，所以这个优良的小群体在每一个世代都可能导致遗传变异的丧失，其基因类型或基因频率不可能与原群体携带的基因类型完全一致。经过数个世代后该小群体的遗传变异会与原群体的遗传变异会与原群体发生漂变和变异的流失。实际上遗传漂变也是一种延长的遗传瓶颈变异。

（三）负向选择

在不良条件下，养殖对象受自然条件影响也会发生变异，自然选择产生作用。这样的变异会朝着适应恶劣好、条件的方向变异，也就是降低生活力或其他生产力性状来适应恶劣的条件。这种变异很同源在一个封闭的群体中扩散，大战并达到一定频率，从而影响种群的品质。 （四）非随机的交配

当群体足够大时，如果不能保证自由交配也会导致某种程度的近亲交配。养殖条件下的鱼类的繁殖多是在人工条件下，由人工控制全过程的，即人工繁殖。在进行人工繁殖的操作当中，亲本对选择不可能是随机的，而且雄性个体的重复利用现象也很严重。非随机的交配以及同一父本使得后代具有相似的血缘关系的个体数量增加，它们的后代再次繁殖时近亲交配的机会成比率增加，导致近亲交配和遗传基础的变异发生。

近亲交配是小群体繁殖时有亲缘关系个体间的交配，或人为因素造成的大群体，不同生殖个体之间的非随机的交配，尤其是全同胞，半同胞的交配。近亲交配可以引起严重的生长性能的衰退现象。 二、近亲交配衰退

近亲交配能导致纯型合子的产生，纯型合子中有害隐性基因得以有机会显性，因此近亲交配可以导致个体的生活力、适应力、生长速度、繁殖力等方面的衰退。事实上，遗传瓶颈变异和遗传漂变是近亲繁殖引起的。 （一）近亲交配的发生

人工选择的因素以及由于多数鱼类的繁殖能力较强，后代在人工条件下均能成活或大部分成活，少量的繁殖个体或少量的繁殖活动即可满足生成需要，使得具有变异等位基因的多数个体市区了繁殖和流传后代的机会，只是这些变异丢失，这也是导致浴场养殖群体内产生严重近亲杂交的原因之一。 （二）近亲交配系数

衡量近亲交配程度的单位称为近亲交配系数，用F表示。。近亲交配系数表示从祖先群体的一个特殊点开始所积累的近亲交配的量，具体反映一个世代中纯型合子增加的机会。因此近亲交配系数有交配个体间血缘关系的远近程度所决定。在特定的群体中，所有的等为基因都可以认为是的，此时的群体称为基础群体。基础群体的近亲交配系数（F）为0。在自交生物当中，一个世代的近亲交配系数最大值（F）=0.50。雌雄异体生物种类，兄妹交配、妇女交配或母子交配时的近亲交配系数为0.25。血缘关系再远一些的表兄妹间的交配，在理论上其近亲交配系数则为0.125。在鱼类中近亲交配系数最高的是雌核发育和雄核发育，从理论上讲经减数后的雌核发育后代为完全的纯合子，其近亲交配系数F=1。

在有限自由交配群体中，或在选育后的品系以及育成品种中及育成品种中，有血缘关系的个体间的交配是不可避免的、群体的规模越小，即有效群体越小，群体的近亲交配系数 就越大。根据群体的大小计算近亲交配系数的公式为： △F=1/2Ne

式中，△F为每一个世代的近亲交配系数；Ne为有效群体规模。 （三）近亲交配引起的衰退现象

近亲交配衰退是近亲交配的结果，其表现是生活力的降低和对生长速度的抑制。近亲交配衰退主要来自于同型合子的增加，特别是在一定数量的隐性有害基因称为纯型合子时衰退就更加显著。换言之，近亲交配的衰退是由异型合子减少引起的。

第四节 繁育群体以遗传性能的保护

一、育成品种遗传性能的保护与提纯

纯系品种，一旦品种杂化，混入一些有害基因，使得品种混杂，生产性能就会退化。杂合度的提高会使原有的游离基因的比例降低，杂合进来的等位基因冲淡了原有的基因平衡。混杂的程度实际上也就是混入有害基因的量的多少，因此砸而读的提高优势会降低品种的生产性能。对于纯系品种而言，保持同质性是防止其生长性能退化的重要内容，如果育成品种已经产生了退化现象，提纯和复壮是恢复生长性能基本手段。 二、群体品种以及自然品种的遗传保护

在实际上生产中，如何保护繁育群体的杂合度是一个非常重要的问题，可以用多种方法进行常用的主要有一些5种： （一）尽量使用大规模的随机交配繁育群体 （二）通过系统交配避免近亲交配 （三）定期向繁育群体引进新的成分 （四）正确使用人工繁育技术 （五）创造良好的养殖环境 三、高技术育成养殖对象的遗传管理

无论是多倍体品种，通过性逆转生产的单性群体，还是通过雌雄核发育技术生产的特殊群体，特们的后代会因产生的机制不同表现不同，要区分对待。 1、多倍体品种

2、有性激素诱导，性逆转生产的单性型群体

3、由性别转换形成的三系配套技术而生产的单性型群体 4、由雄核发育或雌核发育生产的群体

5、转基因品种