一种单链快速建库方法及建库仪器[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111455469 A(43)申请公布日 2020.07.28

(21)申请号 202010265134.1(22)申请日 2020.04.07

(71)申请人 深圳易倍科华生物科技有限公司

地址 518000 广东省深圳市宝安区新安街

道兴区群辉路3号优创空间2号楼415(72)发明人 徐飞岳　

(74)专利代理机构 深圳市创富知识产权代理有

限公司 44367

代理人 钟文翰(51)Int.Cl.

C40B 50/06(2006.01)C40B 60/14(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图5页

(54)发明名称

一种单链快速建库方法及建库仪器(57)摘要

本发明提供一种单链快速建库方法，所述方法包括：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；对所述第一产物按照PCR进行扩增，以得到第二产物；所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文库。此外，本发明还提供一种应用上述方法的建库仪器。本发明提供的单链快速建库方法，通过在同一个反应试管中完成建库反应和扩增反应，节约反应时间，通过一次连接反应完成两端接头连接，减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率。

CN 111455469 ACN 111455469 A

权　利　要　求　书

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1.一种单链快速建库方法，其特征在于，所述方法包括：步骤S10：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；步骤S20：在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；

步骤S30：使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；

步骤S40：对所述第一产物按照PCR进行扩增，以得到第二产物；步骤S50：所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文库。2.根据权利要求1所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述DNA样本包括cfDNA和打断至指定碱基对长度的gDNA。

3.根据权利要求1所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述步骤S20包括：步骤S210：通过退火配对形成第一接头和第二接头；步骤S220：将一个反应试管的所述DNA混合物加入T4DNA连接酶和第一接头，并加入等量第二接头；

步骤S230：加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；步骤S240：等待所述连接酶反应完成，实现所述DNA混合物连接第一接头和第二接头。4.根据权利要求3所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述T4DNA连接酶的终浓度为0.1U/μL～500U/μL。

5.根据权利要求3所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述第一接头和第二接头的浓度均为0.1μM-500μM。

6.根据权利要求1所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述外切酶包括核酸外切酶ExonucleaseIII。

7.根据权利要求6所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述ExonucleaseIII的数量为0.01-1000U。

8.根据权利要求1或6所述的单链快速建库方法，其特征在于，使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应时加入ExonucleaseIII缓冲试剂。

9.根据权利要求1所述的单链快速建库方法，其特征在于，所述单链快速建库方法还包括在加入外切酶反应前先进行纯化处理。

10.一种建库仪器，其特征在于，所述建库仪器包括如权利要求1至9所述的单链快速建库方法。

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一种单链快速建库方法及建库仪器

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【技术领域】

[0001]本发明涉及基因测序文库技术领域,具体涉及一种单链快速建库方法及建库仪器。

【背景技术】

[0002]在目前市场上推出的主要单链建库方法有Swift公司的Accel-NGS Methyl-seq，Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit。[0003]Accel-NGS Methyl-seq主要存在的技术问题有两点。第一是3’端连接时引入的接头会有6-8bp的随机引物，导致生信分析时需要特殊处理，平均切除10bp的碱基，导致数据量下降。并且在测序时需要加入大量的 phix以加大文库多样性从而避免测序仪爆屏的问题。第二是测序的对象不是DNA模板链本身，而是模板链的互补产物链，引入了更多不确定性。同时。该项技术被国外垄断，单个样本建库价格极高，难以大规模推广应用。[0004]Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit单链建库技术同样存在着检测的DNA序列为模板链的互补产物，并且由于采用随机引物扩增，也会导致分析时需要剪切掉部分序列，造成数据浪费。该技术具有一定的偏向性，且技术本身不稳定，市场反应较差。[0005]Splinted adaptor tagging(SPLAT)技术主要存在的问题有：1.耗时长，由于采用低浓度的连接酶以及需要纯化两次连接产物导致反应时间较长。SPALT技术采用的连接酶单位浓度低(5U/μl)，酶的最大反应量为 30U，导致每次连接时间长达1小时，由于要分别进行3’端及5’端接头连接，连接时间长达2小时。同时在反应过程中需要进行多步纯化，也需要耗费一段时间，并且纯化磁珠丢弃也造成了部分DNA损失。2. 所需DNA模板量较多，模板需要100ng，对于低起始量的DNA进行建库存在一定困难。

[0006]现有的单链建库技术中对SPLAT技术加以改进提高，可以进一步缩短时间并降低建库损失，但仍然存在操作复杂，DNA两端接头需要分批次加入导致原料浪费，建库效率低下的问题。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率。

[0008]为实现上述目的，本发明提供一种单链快速建库的方法，所述方法包括：[0009]步骤S10：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；[0010]步骤S20：在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；[0011]步骤S30：使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；

[0012]步骤S40：对所述第一产物按照PCR进行扩增，以得到第二产物；[0013]步骤S50：所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文

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库。

进一步地，所述DNA样本包括cfDNA和打断至指定碱基对长度的 gDNA。

[0015]进一步地，所述步骤S20包括：[0016]步骤S210：通过退火配对形成第一接头和第二接头；[0017]步骤S220：将一个反应试管的所述DNA混合物加入T4DNA连接酶和第一接头，并加入等量第二接头；[0018]步骤S230：加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；[0019]步骤S240：等待所述连接酶反应完成，实现所述DNA混合物连接第一接头和第二接头。

[0020]进一步地，所述T4DNA连接酶的终浓度为0.1U/μL～500U/μL。[0021]进一步地，所述第一接头和第二接头的浓度均为0.1μM-500μM。[0022]进一步地，所述外切酶包括核酸外切酶ExonucleaseIII。[0023]进一步地，所述ExonucleaseIII的数量为0.01-1000U。[0024]进一步地，使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应时加入 Exonuclease III缓冲试剂。

[0025]进一步地，所述单链快速建库方法还包括在加入外切酶反应前先进行纯化处理。[0026]此外，本发明还提供一种建库仪器，所述建库仪器包括上述的单链快速建库方法。[0027]与现有技术相比，本发明提供的单链快速建库的方法，通过在同一个反应试管中完成建库反应和扩增反应，节约反应时间，通过一次连接反应完成两端接头连接，减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率，同时，通过使用外切酶反应处理连接后产物，减少游离接头，进一步减少引物二聚体的形成。【附图说明】

[0028]图1为本发明实施例提供的单链快速建库方法的流程示意图；

[0029]图2为本发明实施例提供的单链快速建库方法的图示说明的流程示意图；[0030]图3为图1中步骤S20的流程示意图；

[0031]图4为本发明实施例提供的建库胶片示意图；[0032]图5为本发明实施例提供的测序分析converted lambda DNA长度分布示意图；[0033]图6为本发明实施例提供的测序分析converted lambda DNA甲基化含量结果示意图。

【具体实施方式】

[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0035]需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。[0036]请一并参阅图1和图2，本发明提供一种单链快速建库的方法，所述方法包括：

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步骤S10：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；

[0038]步骤S20：在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；其中，所述第一接头和第二接头为双链接头；[0039]步骤S30：使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；

[0040]步骤S40：对所述第一产物按照聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)进行扩增，以得到第二产物；[0041]步骤S50：所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文库。

[0042]具体地，本发明提供的单链快速建库的方法，针对提供的DNA样本经多聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase，PNK)处理得到DNA混合物，所述DNA混合物即为单链DNA模板。具体在一实施例中，所述 DNA样本包括循环游离DNA或者细胞游离DNA(Circulating free DNA or Cell free DNA，cfDNA)和打断至指定碱基对长度的基因组DNA (genomic DNA，gDNA)，gDNA经打断至100-400碱基对数目(base pair，bp)，若需要甲基化测序则需经重亚硫酸盐处理，在一实施例中，所述单链建库方法得到的文库用于甲基化测序，在将所述样本DNA进行磷酸化处理的步骤之前，先用重亚硫酸盐处理。

[0043]所述DNA样本经过多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物，具体在一实施例中，所述多聚核苷酸激酶处理包括多聚核苷酸激酶15min 37℃处理15分钟，再加热到95℃反应5分钟，反应完成的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。[0044]请一并参阅图2和图3所示，所述步骤S20包括：[0045]步骤S210：通过退火配对形成第一接头和第二接头；[0046]步骤S220：将一个反应试管的所述DNA混合物加入T4DNA连接酶和第一接头，并加入等量第二接头；[0047]步骤S230：加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；[0048]步骤S240：等待所述连接酶反应完成，实现所述DNA混合物连接第一接头和第二接头。

[0049]具体在实施例一中，基于illumina测序平台的碱基序列为：[0050]A3-1序列如下所示：

[0051]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN–aminom odiferaminomodifer(SEQ IDNO.1)，其中

[0052]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT是illumina接头 (adaptor)的部分序列，负责与A3-2互补配对，NNNNNN是随机序列，N 个数为2-25之间。[0053]A3-2序列如下所示：

[0054]P-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA(SEQ IDNO.2)， AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA是illumina接头 (adaptor)的部分序列，负责与A3-1互补配对。[0055]A5-1序列如下所示：

[0056]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.3)， ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT是illumina接头 (adaptor)的部分序列，负责与A5-2互补配对。[0057]A5-2序列如下所示：

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NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT，(SEQ IDNO.4)，其中AGATCGGAAGA

GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT是illumina接头(adaptor)的部分序列，负责与A5-1互补配对，NNNNNN是随机序列，N个数为2-25之间。[0059]具体在实施例二中，基于MGI测序平台的碱基序列为：[0060]A3-1序列如下所示：

[0061]TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTNNNN–aminomodifer (SEQ IDNO.7)，其中TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT 是MGI接头(adaptor)的部分序列，负责与A3-2互补配对，NNNNNN是随机序列，N个数为2-25之间。[0062]A3-2序列如下所示：

[0063]P-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(SEQ IDNO.8)， AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA是MGI接头(adaptor) 的部分序列，负责与A3-1互补配对。[00]A5-1序列如下所示：

[0065]TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ IDNO.9)，TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT是 MGI接头(adaptor)的部分序列，负责与A5-2互补配对。[0066]A5-2序列如下所示：

[0067]NNNNNNAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCCTTAGGAAGACAA， (SEQ IDNO.10)，其中[0068]AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCCTTAGGAAGACAA是MGI接头 (adaptor)的部分序列，负责与A5-1互补配对，NNNNNN是随机序列，N 个数为2-25之间。

[0069]本发明实施例一和实施例二是基于illumina及MGI平台设计，但不限于此两种平台，也适用于Nanopore平台等其他平台，只需要合成相关平台的特定接头即可，方法通用，均在本发明的保护范围。[0070]优选地，所述adaptor选择带分子标签的接头,通过在接头的连接端加入随机，半随机，固定的碱基作为分子标签。优选的含分子标签的接头可以自由组合。A3-2、A5-1序列也可以进行优化缩短，A3-2可适当减少3端碱基个数，A5-1可以缩短5端碱基个数。Illumina平台接头缩短碱基数在0-25bp间，MGI平台缩短碱基数在0-25bp间。对应的A3-1及 A5-2也缩短对应长度。

[0071]以上A3-1与A3-2退火配对，形成接头第一接头。A5-1与A5-2退火配对，形成第二接头。所述第一接头和第二接头的浓度均为0.1μM-500 μM，存储于-20℃冰箱，其中，μM是浓度单位，表示百万分比浓度。

[0072]将一个反应试管的所述DNA混合物加入T4DNA连接酶和第一接头，并加入等量第二接头；所述T4DNA连接酶的终浓度为0.1U/μL～500 U/μL，其中，U为效价单位，μL表示微升。加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；根据连接酶的反应条件设定反应温度和反应时长，具体在本实施例中，加水补足体积后于20-30℃反应10-15分钟。等待所述连接酶反应完成，实现所述DNA混合物连接第一接头和第二接头。本发明也可使用低浓度连接酶进行反应，如life T4DNA ligase(5U/ μL)，但需要延长连接时间至1小时。[0073]使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；所述ExonucleaseIII的数量为0.01-1000U。具体在一实施例中，使用核酸外切酶Exonuclease III，37℃反应10-20min，70℃反应20min。优选的可以加入Exonuclease III缓冲试剂。优选的，可以在此操作前先进行磁珠纯化后再经Exonuclease III处理。通过使

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用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，有效对接头引物做处理，减少游离接头，进一步减少引物二聚体的形成。

[0074]具体地磁珠纯化处理是在同一反应管中，按照1:1.8至1:2比例加入 AMPure XP磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。具体在一实施例中，使用美国贝克曼库尔特公司的AMPure XP磁珠进行纯化。然后在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，95℃反应5分钟，反应完成的含磁珠的DNA 混合物可直接进行PCR扩增或进一步去除磁珠后进行PCR扩增。[0075]按照PCR反应体系进行扩增，具体在上述的实施例一中，引入 illumina Index，引物序列如下：

[0076]I5-index：

[0077]5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC‘X6’ACACTCTTTCCCT ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ IDNO.5)；[0078]I7-index：[0079]5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT‘Y6’GTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ IDNO.6)。[0080]其中，X6/Y6分别为Index。[0081]按照PCR反应体系进行扩增，具体在上述的实施例二中，引入华大智造MGI Index(Ad153_PCR2_1/Ad153_PCR2_2)，引物序列如下：[0082]Ad153_PCR2_1:longΩ：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACT-3’ (SEQ IDNO.11)；[0083]Ad153_PCR2_2：[0084]5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG‘Y6’TGTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTG GCCTCCG-3’(SEQ IDNO.12)。[0085]其中，Y6为Index。Index序列根据华大智造公布序列为准，也可进行双Index扩增。[0086]按照PCR反应说明进行扩增，扩增完成的第二产物按照1：1-1：1.2 比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，产物可以进入下一步测序或捕获阶段。[0087]此外，本发明还提供一种建库仪器，所述建库仪器包括上述的单链快速建库方法。[0088]与现有技术相比，本发明提供的单链快速建库的方法，通过在同一个反应试管中完成建库反应和扩增反应，节约反应时间，通过一次连接反应完成两端接头连接，减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率，同时，通过使用外切酶反应处理连接后产物，减少游离接头，进一步减少引物二聚体的形成。[00]本发明实施例先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。[0090]本实施例针对10ng gDNA和lambda DNA(非甲基化DNA)进行建库，其中gDNA和lambda DNA各分为两组，一组经过重亚硫酸盐处理作为甲基化建库模板(Converted DNA)，一组不做处理。根据以上建库方法得到建库产物，并由Thermofisher Qubit定量，并跑胶检测产物峰图。[0091]其中，转化的lambda DNA(Converted lambda DNA)进行测序(illumina 平台)，数据量为200M。本发明不仅可以用于甲基化建库方案，还可以用于常规DNA建库。[0092]具体地，测试样本数据如表1所示：

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表1

编号 样本类型 1 2 3 4

gDNA

Converted gDNA Lambda DNA

Converted lambda DNA

DNA样本量 10ng 10ng 10ng 10ng

PCR cycles 15 15 15 15

文库的浓度与体积 17.7ng/μL,20μL 23.4ng/μL,20μL 16.5ng/μL,20μL 18.5ng/μL,20μL

文库总量 354ng 468ng 330ng 370ng

[0095]

表1中，ng是纳克单位，ng/μL是每微升纳克单位，μL是微升单位，PCR cycles是PCR

轮数。

表1列出的是使用本发明提供的单链快速建库方法对gDNA、Lambda DNA及转化的

gDNA(Converted gDNA)和转化的Lambda DNA (Converted lambda DNA)的建库出库产量。表1中，样本编号1对应 gDNA，样本编号2对应converted gDNA，样本编号3对应lambda DNA，样本编号4对应converted lambda DNA。[0097]请参阅图4所示，使用本方法对gDNA lambda DNA及转化的gDNA (converted gDNA)和转化的lambda DNA(Converted lambda DNA)的建库胶图。其中样本编号1对应gDNA，样本编号2对应converted gDNA，样本编号3对应lambda DNA，样本编号4对应converted lambda DNA。[0098]请参阅图5，为本发明实施例提供的测序分析converted lambda DNA 长度分布。[0099]请参阅图6，为本发明实施例提供的测序分析converted lambda DNA 甲基化含量结果，P1是唯一回帖占比73.7％，P2是无回帖占比0.338％， P3是多种回帖占比26％，P4是无基因序列占比0％。分析得到的甲基化含量为：甲基含量CPG占比0.60％,CHG占比0.60％，CHH占比0.70％，未知的甲基化C含量占比为0。[0100]以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

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图2

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图3

图4

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