２００９．１（总第１５２期） Ｉ山东食品发酵 酶法转化头孢菌素Ｃ成为７一氨基头 孢烷酸的研究进展 刘福强李盛华 （山东轻工业学院食品与生物工程学院济南２５０３５３） 摘要７一氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）是生产头孢菌素的重要原料，目前大多由头孢菌素ｃ通过化学法或酶法转化而来。本 文综述了两步酶法生产７－ＡＣＡ的研究进展，并详细阐述了催化过程用到的Ｄ一氨基酸氧化酶和ＧＬ一７－ＡＣＡ酰化酶的酶学特 性、表达、纯化及固定化。 关键词７一氨基头孢烷酸Ｄ一氨基酸氧化酶ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶头孢茵素ｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ ｔｏ ７－ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ ＬＩＵ Ｆｕ－－ｑｉａｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＦｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＬｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊｉｎａｎ ２５０３５３） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ７－ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ，ａ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ ｂｙ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｒ ｂｙ ａ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ ｔｏ ７－ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｄ—ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｒｙｌ一７一ＡＣＡ ａｃｙｌａｓｅ ｉｓ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｔａｉｌｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：７一ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ；Ｄ—ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ；ｇｌｕｔａｒｙｌ一７－ＡＣＡ ａｃｙｌａｓｅ；ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ 前言 直接作用于ＣＰＣ的侧链生成７一ＡＣＡ，该法工艺简 少，不适于工－业化生产；两步酶法即利用Ｄ一氨基 酸氧化酶（ＤＡＡＯ）和戊二酰基－７一氨基头孢烷酸 头孢菌素类抗生素是一族Ｂ－内酰胺类广谱抗 单、成本低，但目前此类酶活性较低且种类较 生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁 的破坏而起到杀菌作用，具有抗菌谱广、抗菌活 性强、疗效高、毒性低等优点，近年来使用越来 越广泛。７一氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）是合成许多 半合成头孢菌素类抗生素的重要中间体，是当今 酰化酶两步酶促反应将ＣＰＣ转化为７一ＡＣＡ，是目 前主要研究的方法。 国际抗生素市场的主要角色【 。目前，国内外工 业生产上主要采用化学法生产７一ＡＣＡ，成本高、 １二步酶法转化ＣＰＣ为７－ＡＣＡ ＣＰＣ在ＤＡＡＯ的催化下，产生了一个具有酮 工艺复杂、三废污染严重，需使用大量危险化学 基的中间体和Ｈ：Ｏ 。此中间体不稳定，易与Ｈ：Ｏ 品。因此，研究人员正致力于酶法生产７一ＡＣＡ的 反应，被Ｈ ０：氧化脱羧，变成戊二酰基一７一氨基头 研究。较之化学法，酶法具有工艺简单、低成 孢烷酸（ＧＬ一７一ＡＣＡ），然后ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶 本、低污染、高产高质等优点。酶法生产７一ＡＣＡ （ＧＬ一７－ＡＣＡ ａｃｙｌａｓｅ）作用于ＧＬ一７一ＡＣＡ脱去其侧 有两种：一步酶法和两步酶法。一步酶法，即酶 链，生成７－ＡＣＡ。 Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ——１７—— 山东食品发酵 ２００９．１（总第１ ５２期） １．１ ＤＡＡＯ转化ＣＰＣ为ＧＬ一７－ＡＣＡ 方法和疏水性层析法，即先用（ＮＨ４） ＳＯ 沉淀获 ＤＡＡＯ可以可溶性物或固定化形式用于ＣＰＣ 得粗品，然后在苯基一琼脂糖凝胶￣ＮＤＥＡＥ一纤维素 向ＧＬ一７一ＡＣＡ的转化。 柱上作两步柱层析；或者用双水相萃取技术进行 １．１．１ ＤＡＡＯ性质及来源ＤＡＡＯ是一种以黄素腺 分离纯化，细胞蛋白被萃取到磷酸盐溶液相中， 嘌呤（ＦＡＤ）为辅基的黄素蛋白酶类，属于结构 ＤＡＡＯ被ＰＥＧ￣Ｈ萃取；还可采用基因改造的方法， 选择性催化剂；可氧化Ｄ一氨基酸的氨基生成相 在ＤＡＡＯ的Ｎ端接上６个组氨酸，利用组氨酸与金 应的酮酸和氨；底物专一性较低，可作用于Ｄ一 属敖合介质的亲和特性，采用Ｈｉｓ—ＴＡＧ柱即可纯 氨基酸，亦可作用于具有Ｄ一氨基的化合物（如 化，此法既能完整地保持其生物活性，又能简化 ＣＰＣ），但ＤＡＡＯ不能作用于Ｄ一天门冬氨酸和Ｄ一 操作、提高收率。 谷氨酸；在溶液中多以单体和二聚体的形式存 １．１．４ ＤＡＡＯ的稳定性ＤＡＡＯ在冷冻（一２０℃）状 在。ＤＡＡＯ广泛来源于哺乳动物人、鼠、兔、猪 态下、ｐＨ８．３的２０ｍｍｏｌ／Ｌ焦磷酸盐中是稳定的， 等的肝、脑等组织器官中，以及三角酵母、红酵 解冻和冷冻均不影响活性。室温下，ＤＡＡＯ稳定 母、腐皮镰孢霉、曲霉、藻类、细菌等微生物中 性较差；２３℃、ｐＨ７．０～７＿３时，三角酵母的ＤＡＡＯ 口］。目前，应用于７－ＡＣＡ酶法生产的ＤＡＡＯ主要 酶活半衰期只有１０～１５ｈ Ｊ；３０￣Ｃ、１０％甘油稳定 来源于酵母菌，这是因为在以ＣＰＣ为底物时，酵 剂的条件下，半衰期仅为１２～１４ｈ ；无Ｏ２和Ｈ２Ｏ２ 母菌来源的ＤＡＡＯ催化效率高于哺乳动物来源的 时，２０￣２５℃、ｐＨ ７～８．２的磷酸盐缓冲液中，半 ＤＡＡＯ两个数量级。 衰期可达５０￣７０ｈ，但为实现快速、高产的反应， １．１．２ ＤＡＡＯ底物特异性不同来源的ＤＡＡＯ有各异 必须有Ｏ 和Ｈ２０２存在。ＦＡＤ的脱离是造成ＤＡＡＯ 的特异性底物。用Ｈ Ｏ 酶和邻连二茴香胺结合产 热不稳定的主要原因，向酶液中加入ＦＡＤ￣Ｉ］甘油 生Ｈ Ｏ 的量测定ＤＡＡＯ活力，发现ｐｋＤＡＡＯ的最 可明显改善其热稳定性。此外，对特定的氨基酸 适底物是Ｄ一脯氨酸，ＴｖＤＡＡＯ的最适底物是Ｄ一缬 进行定点突变来改变ＤＡＡＯ的结构或将ＤＡＡＯ固定 氨酸，ＲｇＤＡＡＯ的最适底物是Ｄ一甲硫氨酸，来自 化，也是提高其稳定性的有效途径。 Ｃ．ｂｏｉｄｉｎｉｉ的ＤＡＡＯ最适底物是Ｄ一丙氨酸，且通过 １．１．５ ＤＡＡＯ的固定化对酶进行固定化具有稳定 对比发现，ＴｖＤＡＡＯ对ＣＰＣ有较高亲和性，更适 性高、可重复利用等优点。７．ＡＣＡ催化所用的酶 于工业化生产７－ＡＣＡ。 都是通过交联、吸附、包埋的方式对酶或细胞进 １．１．３ ＤＡＡＯ的表达与纯化ＤＡＡＯ的合成与培养 行固定化的。将ＤＡＡＯ固定在有机载体上能显著 基中的诱导物有直接关系，ＤＡＡＯ易被Ｄ一氨基酸 延长使用时间，常用的固定化载体有：ＣＮＢｒ活 诱导表达，常用的诱导剂是Ｄ一甲硫氨酸￣Ｉ：ＩＤ一丙氨 化的ａｇｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＢ或Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ３６５等 ； 酸。Ｄ一丙氨酸可使ＤＡＡＯ产量增加５．６倍。在三角 有一种新的固定化载体：聚甲基丙烯酸缩水甘油 酵母发酵过程中分别采用Ｎ－氨甲酰基一Ｄ－丙氨酸、 酯树脂，先利用酶蛋白变性的方法去除ＤＡＡＯ中 Ｎ．乙酰基．Ｄ．色氨酸和Ｎ．氨甲酰基－Ｄ—Ｑ－氨基丁酸 的过氧化氢酶，再将ＤＡＡＯ经共价交联到该树脂 作诱导剂，ＤＡＡＯ产量比用Ｄ一丙氨酸作诱导剂时 上，酶对热、ｐＨ、Ｏ：的稳定性都大大提高，且在 分别高出４．２、２．１￣１：Ｉ１．５倍。有学者发现低通氧量也 催化ＣＰＣ的过程中，酮酸中间体随反应批次的增 可以提高ＤＡＡＯ的酶活【４ 】，这可能是因为ＤＡＡＯ 加而逐渐减少。此外，还可采用固定化三角酵母 辅基ＦＡＤ的氧化受氧浓度的影响，细胞需通过增 细胞的形式进行催化。 ＪｊＨＤＡＡＯ的生成量来弥补其低氧浓度时转化速率 １．１．６ Ｈ Ｏ 对ＤＡＡＯ转化ＣＰＣ为ＧＬ一７－ＡＣＡ的影响 的不足。 ＣＰＣ首先在ＤＡＡＯ作用下与０：反应生成Ｑ一酮己二 ＤＡＡＯ的分离纯化多采用传统方法，即酶液 酸单酰一７一ＡＣＡ，再与Ｈ２Ｏ２反应生成ＧＬ一７一ＡＣＡ。 经盐析沉淀、热处理、等电点沉淀，再用色谱进 ａ一酮己二酸单酰．７一ＡＣＡ是造成目标产物收率低 行纯化。变异三角酵母ＤＡＡＯ的纯化可采用常规 的关键因素之一。反应过程中Ｈ Ｏ 浓度过低，则 ——１８——Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ２００９．１（总第１ ５２期） Ｉ山东食晶发酵 会造成Ｑ一酮己二酸单酰一７一ＡＣＡ积累并分解；积 １．２．２ ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶重组菌的构建在国外， 累浓度过高则会氧化ＤＡＡＯ中半胱氨酸和丝氨酸 ＧＬ－７一ＡＣＡ酰化酶已应用到７一ＡＣＡ的工业化生产， 等残基，从而造成酶的失活，同时也会氧化ＣＰＣ 国内工业用ＧＬ．７．ＡＣＡ酰化酶仍依赖进口，因此 ￥￣／ＧＬ．７．ＡＣＡ等成为亚砜类物质。这个问题可采 构建高酶活的ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶生产菌株意义重 用在反应过程中加入适量的双氧水的方法，使剩 大【１ 。国内重组基因工程菌有：重组大肠杆菌 余的Ｑ一酮己二酸单酰一７一ＡＣＡ转化为ＧＬ一７一ＡＣＡ， ＪＭ１０５／ｐＭＫＣ．ＡＣＹ【１ ，在最优条件下，上罐补 从而提高裂解的收率，再加入适量的Ｈ：Ｏ 酶除掉 料高密度发酵产物酶活达６６６８．９Ｕ／Ｌ；大肠杆菌 多余的Ｈ Ｏ：。也可通过改进氧化分布器或搅拌速 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＹＷ－ＧＡ，产物最高酶活可达３４６３．８Ｕ／ 度、氧气流量以控制溶液溶氧浓度的方法来 Ｌ：罗辉构建的重组大肠杆菌，产物酶活为２６６Ｕ／ 提高收率。有研究表 Ｉｌ１］，向反应体系中添加 Ｌ，再经一步ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化即可达￣０８０％的 ６％的Ｈ ｏ：可使Ｇｌ－７－ＡＣＡ生成率提高为７３．Ｏ％；将 纯度。 透性化的ＦＡ１０细胞在ｐｉｌｌ０．５～１ １．０、２０℃下保温 １．２．３ ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶的表达和纯化野生菌株 ３０ｍｉｎ，ＧＬ一７一ＡＣＡ的生成率可达８４％。 在培养过程中通常采用戊二酸来诱导酰化酶的表 １．２酰化酶裂解ＧＬ一７一ＡＣＡ产生７一ＡＣＡ 达，且部分菌株经诱导后便不再需要戊二酸的诱 １．２．１ ＧＬ．７一ＡＣＡ酰化酶的性质及来源较之 导也能产生高酶活的酰化酶。此外，将酰化酶基 ＤＡＡＯ，ＧＬ一７－ＡＣＡ酰化酶活性较低，是酶法生产 因的信号肽去除后，采用Ｅ．ｃｏｌｉ的启动子也能得到 ７－ＡＣＡ的瓶颈。具有ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶活性的菌株 很好的表达效果，但采用Ｅ．ｃｏｌｉ作宿主经常导致外 通常都是从土壤或污水中筛选得到的。许多的微 源蛋白形成不溶性的包涵体 ，应对这个问题， 生物具有ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶活性，但真正具有应用 可以采用分泌表达型质粒，或使用分泌型宿主。 前途的是假单胞菌的一些突变株。Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｉｓｏｇａｉ 由于野生菌株培养困难，且往往存在导致底物及 和Ｍａｔｓｕｄａ等分别从土壤中筛选到了能产生ＧＬ一７一 产物降解的Ｂ一内酰胺酶和酯酶，因此人们将酰化 ＡＣＡ酰化酶的菌株 卜Ｈｊ。 酶基因进行了克隆和表达【ｌ ∞】，见表１。 表１ ＧＬ－７－ＡＣＡ化酶的重组表达 酰化酶通常用色谱法进行纯化，包括６步：细 ＣＬ－６Ｂ￣Ｉ］ＨＡ—Ｕｌｔｒａｇｅｌ两步色谱纯化，产物纯度即 胞经匀浆得到酶粗提液；在２％硫酸铵存在下５０￣Ｃ 超过９０％。一般，不同来源的ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶要 进行热处理，此步仅使酰化酶少量失活，却能去 采用不同的纯化方法口”。 除杂酶（酯酶和 －内酰胺酶）；混合物经超滤 １．２．４ ＧＬ－７一ＡＣＡ酰化酶的稳定性ＧＬ．７一ＡＣＡ酰化 处理后再进行四步色谱操作：Ｑ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＨＴＰ 酶热稳定性较好，在Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａ １ ４，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｐｔｉｔｅ，ＳＰ—Ｔｒｉａｃｙｌ，Ｓ一３００。另外，新发现 Ｊ１￣Ｉ］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＢＬ０７２中，此酶在５０℃下可保持 一种简单有效的纯化方法，即用ＤＥＡＥ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ９０％的酶活，但前两株菌的ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶仅在 Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ——１９ 山东食品发酵 ２００９．１（总第１５２期） ｐＨ ８－９时稳定，而７一ＡＣＡ￣［］ＣＰＣ在碱性条件下不 融细胞固定化，用于氧化ＣＰＣ，转化率达９２％，产 稳定；此外，它们的酰化酶活性还受缓冲液类型 生ＧＬ一７一ＡＣＡ的能力为９．２ ｍｇ／ｇ固定化细胞・小时。 的强烈影响（使用甘氨酸缓冲液时，其活性要比 罗辉等提出了一条游离细胞反应与膜分离耦合的 使用磷酸盐或Ｔｒｉｓ—ＨＣＬ缓冲液高５～１０倍［２ ）， ７－ＡＣＡ生产新工艺，并发现中空纤维超滤膜可以 因此这两种菌的应用受到很大的。但经固定 将反应体系中的细胞和催化产物分离，结晶后， 化后，ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶的稳定性即可显著提高。 ７－ＡＣＡ纯度为９３．１％，结晶收率为５１％。该方法节 Ｍｏｎｔｉ等对固定化ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶重复操作４２批 约生产成本，有很好的应用前景。 次后，其酶活仍为初始值的９３％。 １．２．５ ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶的固定化使用固定化ＧＬ一 ３总结及展望 ７－ＡＣＡ酰化酶进行转化，可提高转化率、减少副 产物、重复利用酶、降低成本，因此适于大规模 头孢菌素Ｃ酶法生产７一ＡＣＡ有化学法生产不可 比拟的优点，也已部分实现了工业化，石药集团 的生产。常用的共价固定化载体有：环氧乙烷基 等大型制药企业已部分采用了酶法生产７一ＡＣＡ， 丙烯酸珠粒和可控制孔径的玻璃珠粒。此外，还 但由于酶法生产目前仍存在较难克服的问题，因 可以先将酶吸附，再同戌二醛交联至阴离子交换 此尚未完全取代化学法，仍需深入研究。 树脂上，但此法固定的酶活低于共价固定的平均 ＤＡＡＯ￣ＩＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶是酶法生产７一ＡＣＡ 酶活。国产固定化ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶的表观米氏 过程中两个重要的酶，提高这两种酶的酶活和稳 常数（Ｋｍ）和最大反应速度（Ｖｍ）分别为８．６９ 定性等对酶法生产７一ＡＣＡ具有重大的意义，也是 ｍｍｏｌ‘Ｌ一１￣Ｎ７６ ｌａ ｍｏｌ‘ｇ—Ｉｍｉｎ一１，均高于游离酶。由 研究重点。过去主要通过酶工程、诱变等方法来 于ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶在重组大肠杆菌中有相当一部 提高酶活、得到高产菌株，随着现代生物技术的 份可能位于细胞间质，因此也可以采取将重组大 发展，基因手段的应用越来越多：利用定点突变 肠杆菌直接固定的方法。 ２酶法生产７－ＡＣＡ举例 的技术来改变酶的结构，以提高酶的活性和稳定 性，通过改变质粒或宿主细胞来提高酶的产量； 通过基因工程手段构建基因工程菌、优化生产工 Ｃｏｎｌｏｎ等 在１ＬＳ￣ＦＩ１０Ｌ的反应器中进行了固定 艺，提高工程菌的酶活；利用基因融合、多基因 化两步酶法制备７一ＡＣＡ的研究，固定化ＤＡＡＯ￣［］ 共表达的方法优化催化过程，从而提高酶活、简 ＧＬ一７一ＡＣＡ酰化酶的半衰期分别为１３８￣Ｎ１７２批次， 化酶的分离纯化过程并降低成本。但这些技术同 双酶法工艺的７一ＡＣＡ综合产量为６７％，最后７一ＡＣＡ 样存在问题，如酶活提高了但稳定性仍不够、构 结晶产品的纯度为９７．４％；Ｋ．Ｆ．Ｗｏｌｆ－￣口 提出改造 建成本高、大肠杆菌作为宿主菌易出现无活性包 戊二酰基酰胺酶结构改造以实现从ＣＰＣ￣Ｕ７一ＡＣＡ 涵体等。探索更好的酶的固定化方法、进一步研 的一步酶法转化的构想；Ｑ．Ｔａｎ等提出利用固定化 究不同载体上的固定化和共固定化、开发新型的 细胞结合酶和载体结合酶在单孔内将ＣＰＣ转化成 反应和分离耦合工艺等，都是今后的研究方向，７－ＡＣＡ，产率达９０％。 也将是酶法生产７．ＡＣＡ的发展方向。 在国内，杨利敏等利用固定化ＤＡＡＯ￣Ｉ］ＧＬ－７一 我国人口众多，市场需求潜力巨大，抗生 ＡＣＡ酰化酶裂解得到７－ＡＣＡ，总收率达７４％，含 素类药物在我国发展前景广阔。目前，第三、四 代头孢类抗生素开发与仿制发展势头迅猛，也带 载体上，反应同时利用这两种酶以类似一步方式 动了相关中间体的飞速发展。国外大制药公司从 量＞９８％；而廖福荣 则将两种酶分别固定于不同 进行，在最优化条件下ＣＰＣ转化为７一ＡＣＡ的转化 发展中国家大量进口医药中间体，为抗生素类中 率高于９０％；也有学者提出将两种酶固定在同一 间体的研究开发及生产创造了良好的条件。在世 介质上，但Ｂｉａｎｃｈｉ等通过实验证明这并非是最好 界各国越来越重视环境保护的大环境下，环境污 的选择。李维泉等【２叫将三角酵母进行种内融合得 染严重的化学法生产７．ＡＣＡ必将被酶法生产所取 到三角酵母的二倍体，成功地提高了ＤＡＡＯ的活 代，酶法生产７一ＡＣＡ拥有发展潜力巨大。’ （参考文献略） 力；任克勤等［２ 将ＤＡＡＯ高产菌株三角酵母的冻 ——２０——Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
