乳酸菌冻干粉制作方案
1.材料
1.1菌种
乳酸菌
1.2培养基
MRS培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g、吐温80 1ml、PH值6.2~6.4、用蒸馏水定容至1000ml，115-120℃灭菌30min。
计数培养基：1LMRS培养基加入琼脂20g
2.技术路线
2瓶100mlMRS
3瓶500mlMRS
24h后平板检测纯度和活菌数，转入活化2
活化1
乳酸菌
40L发酵罐培养48h
24h后平板检测纯度和活菌数，转入
24h后平板检测纯度和活菌数
离心收集菌泥
加保护剂 纯度检测 成品 冷冻干燥14h
3.主要试剂和仪器3.1试剂
奶粉、甘露醇、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸三氨、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、吐温、蒸馏水、生理盐水等。
3.2仪器
高压灭菌锅、培养箱、无菌操作台、高速离心机、发酵罐、真空冷冻离心机、菌液瓶等
4.具体实施方案
4.1乳杆菌活化
将实验室冰箱保藏的德氏乳杆菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37 ℃，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后再将上述100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h。
4.2活菌数的测定
菌种经活化、扩培后，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10-8、10-9、10-10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿。待培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30-300之间的培养皿计菌落数。
4.3 菌体收集
利用超速离心机对发酵后的菌液进行离心，在转速为4000-6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物。
4.4菌泥冷冻干燥
将收集到的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液。再将其盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min，然后置-80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中。根据实验设计，真空冷冻干燥条件设置冻干仪腔体温度为-60℃-70℃，压力为0.006Pa，时间为14h。
4.5存活率测定
冷冻干燥后的乳酸菌以生理盐水复活，进行平板计数，结果以个/g表示。
