一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112779195 A(43)申请公布日 2021.05.11

(21)申请号 202110316101.X(22)申请日 2021.03.24

(71)申请人 湖南农业大学

地址 410128 湖南沙市芙蓉区农大路1

号(72)发明人 尹杰　李云霞　马杰　夏嗣廷　

谭军　黄兴国　李铁军　印遇龙　(74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所

(普通合伙) 11491

代理人 张国栋(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12N 1/04(2006.01)

权利要求书2页 说明书6页 附图1页

(54)发明名称

一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺(57)摘要

本发明公开了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3,10‑4和10‑5中；S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养24‑48h，得到所需的乳酸菌菌落。本发明将菌液涂布在MRS琼脂培养基上，MRS琼脂培养基上含有特定含量的葡萄糖、蛋白胨和酵母膏等复配的冻干保护剂，此外，结合冻干后的真空‑充氮研磨粉碎技术，能够有效避免冻干粉在粉碎过程中吸收环境的水分。

CN 112779195 ACN 112779195 A

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1.一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3,10‑4

和10‑5中；S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养24‑48h，得到所需的乳酸菌菌落；

S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1‑2次，直至得到纯菌落，实现；

S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；

S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；

S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10‑8,10‑9和10‑10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；

S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30‑300之间的培养皿计菌落数；

S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，在转速为4000‑6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；

S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入‑30℃冰箱60min，然后置‑80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理；

S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空‑充氮研磨操作以及包装处理，即得到所需的乳酸菌冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S3中制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml。

4.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基的PH值为6.2‑6.4，用蒸馏水定容至1000ml，在115‑120℃下灭菌25‑35min。

5.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S9中的复配保护剂的组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用。

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6.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S9中真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为‑60℃至‑70℃，压力为0.005至0.006Pa，时间为13‑14h。

7.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S8中的离心操作是在高速离心机下进行操作。

8.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S10中的真空充氮研磨的操作是指：将菌泥置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度介于‑0.085至‑0.095MPa，然后喷入液氮，冻干物料与液氮的质量体积比例为1:1‑1.5，开动球磨机进行研磨，把冻干物料研磨成50‑100目的冻干粉。

9.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S10中包装是将所得的冻干粉在相对湿度在30‑35％的环境下，用铝膜包装封口。

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一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺

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技术领域

[0001]本发明涉及乳酸菌冻干粉技术领域，具体为一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺。背景技术

[0002]乳酸菌是一类可发酵碳水化合物，主要生成乳酸的细菌总称，随着乳酸菌对人体健康有益作用机理研究的不断深入以及人们保健意识的增强，乳酸菌得到越来越多的关注和研究开发，目前已被广泛应用于营养保健、食品、医药、饲料添加剂等行业中。[0003]目前乳酸菌多以冻干粉的形式供应市场，乳酸菌的菌种有双歧杆菌、德式乳杆菌等，在制备的过程中，乳酸菌直接进行冷冻干燥时很容易衰退失活，活菌稳定性低，使得微生物细胞容易造成损伤，降低了细胞的生物活性，从而降低了活菌率，从而降低了冻干粉在食品、医药以及添加剂等行业中的应用，为此，我们提出了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺来解决上述问题。

发明内容

[0004]针对现有技术的不足，本发明提供了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。[0005]为实现上述目的，一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，本发明提供如下技术方案：包括以下步骤：[0006]S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3

,10‑4和10‑5中；[0007]S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养24‑48h，得到所需的乳酸菌菌落；[0008]S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1‑2次，直至得到纯菌落，实现；[0009]S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；[0010]S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；[0011]S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10‑8,10‑9和10‑10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；

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S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养

48h，选取菌落数在30‑300之间的培养皿计菌落数；[0013]S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，在转速为4000‑6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；[0014]S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入‑30℃冰箱60min，然后置‑80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理；[0015]S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空‑充氮研磨操作以及包装处理，即得到所需的乳酸菌冻干粉。[0016]进一步优化本技术方案，所述步骤S3中制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定。

[0017]进一步优化本技术方案，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml。

[0018]进一步优化本技术方案，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基的PH值为6.2‑6.4，用蒸馏水定容至1000ml，在115‑120℃下灭菌25‑35min。[0019]进一步优化本技术方案，所述步骤S9中的复配保护剂的组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用。[0020]进一步优化本技术方案，所述步骤S9中真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为‑60℃至‑70℃，压力为0.005至0.006Pa，时间为13‑14h。[0021]进一步优化本技术方案，所述步骤S8中的离心操作是在高速离心机下进行操作。[0022]进一步优化本技术方案，所述步骤S10中的真空充氮研磨的操作是指：将菌泥置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度介于‑0.085至‑0.095MPa，然后喷入液氮，冻干物料与液氮的质量体积比例为1:1‑1.5，开动球磨机进行研磨，把冻干物料研磨成50‑100目的冻干粉。

[0023]进一步优化本技术方案，所述步骤S10中包装是将所得的冻干粉在相对湿度在30‑35％的环境下，用铝膜包装封口。[0024]与现有技术相比，本发明提供了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，具备以下有益效果：[0025]1、该乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，本发明将菌液涂布在MRS琼脂培养基上，MRS琼脂培养基上含有特定含量的葡萄糖、蛋白胨和酵母膏等复配的冻干保护剂，此外，结合冻干后的真空‑充氮研磨粉碎技术，能够有效避免冻干粉在粉碎过程中吸收环境的水分，影响菌落的活性，从而提高了该乳酸菌冻分离和干粉制作工艺的使用效果。[0026]2、该乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，本发明复配保护剂的添加，甘露醇和奶粉的配合使用下，使得制备的冻干粉中乳酸菌的存活率均大幅提高，本发明可用于生产高活菌数、高活性的乳酸菌制剂，从而保证了乳酸菌的生物活性，具有操作简单，实用性广等优点。

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附图说明

[0027]图1为本发明提出的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺的流程示意图。

具体实施方式

[0028]下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0029]实施例一：

[0030]请参考图1所示，本发明公开了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，包括以下步骤：

[0031]S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3

,10‑4和10‑5中；[0032]S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养24h，得到所需的乳酸

酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾菌菌落，MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、

2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml，MRS琼脂培养基的PH值为6.2‑6.4，用蒸馏水定容至1000ml，在115‑120℃下灭菌25‑35min；[0033]S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1‑2次，直至得到纯菌落，实现，制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定；[0034]S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；[0035]S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；[0036]S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10‑8,10‑9和10‑10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；[0037]S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30‑300之间的培养皿计菌落数；[0038]S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，离心操作是在高速离心机下进行操作，在转速为4000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；

[0039]S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，复配保护剂的组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用，用振荡器混匀，制成菌

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悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入‑30℃冰箱60min，然后置‑80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理，真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为‑60℃，压力为0.005Pa，时间为13h；[0040]S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空‑充氮研磨操作以及包装处理，真空充氮研磨的操作是指：将菌泥置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度为‑0.085MPa，然后喷入液氮，冻干物料与液氮的质量体积比例为1:1‑1.2，开动球磨机进行研磨，把冻干物料研磨成60目的冻干粉，包装是将所得的冻干粉在相对湿度在30％的环境下，用铝膜包装封口，即得到所需的乳酸菌冻干粉。[0041]实施例二：

[0042]请参考图1所示，本发明公开了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，包括以下步骤：

[0043]S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3

,10‑4和10‑5中；[0044]S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养36h，得到所需的乳酸菌菌落，MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml，MRS琼脂培养基的PH值为6.3，用蒸馏水定容至1000ml，在115℃下灭菌30min；[0045]S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1‑2次，直至得到纯菌落，实现，制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定；[0046]S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；[0047]S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；[0048]S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10‑8,10‑9和10‑10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；[0049]S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30‑300之间的培养皿计菌落数；[0050]S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，离心操作是在高速离心机下进行操作，在转速为5000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；

[0051]S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，复配保护剂的

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组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用，用振荡器混匀，制成菌悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入‑30℃冰箱60min，然后置‑80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理，真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为‑65℃，压力为0.0055Pa，时间为13h；[0052]S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空‑充氮研磨操作以及包装处理，真空充氮研磨的操作是指：将菌泥置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度为‑0.09MPa，然后喷入液氮，冻干物料与液氮的质量体积比例为1:1.2，开动球磨机进行研磨，把冻干物料研磨成80目的冻干粉，包装是将所得的冻干粉在相对湿度在30％的环境下，用铝膜包装封口，即得到所需的乳酸菌冻干粉。[0053]实施例三：

[0054]请参考图1所示，本发明公开了一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，包括以下步骤：

[0055]S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10‑30min，即稀释10‑1的样品液，继续将样品稀释至10‑3

,10‑4和10‑5中；[0056]S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10‑3,10‑4和10‑5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养48h，得到所需的乳酸

酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾菌菌落，MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、

2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml，MRS琼脂培养基的PH值为6.4，用蒸馏水定容至1000ml，在120℃下灭菌35min；[0057]S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1‑2次，直至得到纯菌落，实现，制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定；[0058]S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；[0059]S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；[0060]S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10‑8,10‑9和10‑10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；[0061]S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30‑300之间的培养皿计菌落数；[0062]S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，离心操作是在高速离心机下进行操作，在转速为6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；

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S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，复配保护剂的

组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用，用振荡器混匀，制成菌悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入‑30℃冰箱60min，然后置‑80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理，真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为‑70℃，压力为0.006Pa，时间为14h；[00]S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空‑充氮研磨操作以及包装处理，真空充氮研磨的操作是指：将菌泥置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度为‑0.095MPa，然后喷入液氮，冻干物料与液氮的质量体积比例为1:1.5，开动球磨机进行研磨，把冻干物料研磨成100目的冻干粉，包装是将所得的冻干粉在相

用铝膜包装封口，即得到所需的乳酸菌冻干粉。对湿度在35％的环境下，

[0065]判断标准：通过三个实施例对比，效果最佳者为实施例二，因此，选择实施例二为最佳实施例，具体对量的改变，也属于本技术方案保护的范围。[0066]本发明的有益效果：本发明将菌液涂布在MRS琼脂培养基上，MRS琼脂培养基上含有特定含量的葡萄糖、蛋白胨和酵母膏等复配的冻干保护剂，此外，结合冻干后的真空‑充氮研磨粉碎技术，能够有效避免冻干粉在粉碎过程中吸收环境的水分，影响菌落的活性，从而提高了该乳酸菌冻分离和干粉制作工艺的使用效果；本发明复配保护剂的添加，甘露醇和奶粉的配合使用下，使得制备的冻干粉中乳酸菌的存活率均大幅提高，本发明可用于生产高活菌数、高活性的乳酸菌制剂，从而保证了乳酸菌的生物活性，具有操作简单，实用性广等优点。

[0067]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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CN 112779195 A

说　明　书　附　图

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图1

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