乳酸菌冻干粉制作方案
1. 材料
1.1菌种
乳酸菌
1.2培养基
MRS培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二 钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g、吐温80 1ml、 PH值6.2~ 用蒸馏水定容至1000ml, 115-120C灭菌30min。
计数培 养基: 1LMRS培养基加入琼脂20g
2. 技术路线
乳酸菌
活化1 .
100mlMRS
24h后平板检测纯度十
和活菌数，转入活化2
500mlMRS
发酵罐培养
24h后平板检测纯度
和活菌数，转入
48h —124加保护剂 纯度和活后菌平数板检测 3. 主要试剂和仪器
3.1 试剂
奶粉、甘露醇、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸三 氨、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、吐温、蒸馏水、生理盐水等。
3.2 仪器
高压灭菌锅、培养箱、无菌操作台、高速离心机、 发酵罐、真空冷冻离心机、 菌液瓶等
4. 具体实施方案
4.1 乳杆菌活化
将实验室冰箱保藏的德氏乳杆菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一 次活化，活化温度37 C, 24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后再将上述 100ml 菌液全部转入至 400ml 灭菌 MRS 液体培养基进行第二次活化， 24h 后平 板检测纯度和活菌数，检测达标后转至 40L 发酵罐中进行扩大培养 48h。
4.2 活菌数的测定
菌种经活化、扩培后，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL 发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10、10、 10
-8
-9
-10
三个稀释倍数，吸取 0.2mL 稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入 15mL 左右的计数培养基混匀， 每个稀释度做三个平行培养皿。 待培养基凝固后， 倒置 放入37C恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30-300之间的培养皿计菌落 数。
4.3 菌体收集
利用超速离心机对发酵后的菌液进行离心， 在转速为 4000-6000r/min 的条件 下离心10mi n,去上清收集沉积物。
4.4 菌泥冷冻干燥
将收集到的沉积物加入至复配保护剂， 用振荡器混匀， 制成菌悬液。 再将其 盛入冷冻平皿中，随后先置4°C冰箱平衡30min后，移入-30C冰箱60min，然后 置-
80C冰箱60min,再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥 14h,密封保存于4C冰箱 中。根据
实验设计，真空冷冻干燥条件设置冻干仪腔体温度为 -60C -70C，压力 为0.006PQ时间为14h。
4.5 存活率测定
冷冻干燥后的乳酸菌以生理盐水复活，进行平板计数，结果以个 /g 表示。
