・４６４・ 中华实验外科杂志２００４年４月第２ｌ卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｅｘｏ Ｓｕｒｅ．Ａｐｒｉｌ ２００４，Ｖｏｌ ２１．Ｎｏ．４ ・实验研究・ 肺癌组织中ｐ１ ６基因ｍＲＮＡ表达及其 临床意义 张军航 马琳 刘芙蓉 张学 【摘要】 目的 检测肺癌组织中ｐ１６基因ｍＲＮＡ的表达情况，探讨ｐ１６基因在肺癌发生发展 过程中的作用。方法应用逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）方法检测肺癌组织中ｐ１６基因ｍＲＮＡ 的表达。结果肺良性疾病组织、癌周正常肺组织ｐ１６基因ｍＲＮＡ表达高于肺癌组织，差异有显 著性（Ｐ分别＜０．０５）；小细胞肺癌ｐ１６基因ｍＲＮＡ阳性率（１００％）高于非小细胞肺癌（４６．０％）Ｐ＜ ０．０５；临床Ｉ、Ⅱ期ｐ１６基因ｍＲＮＡ阳性率（７５．０％）高于临床Ⅲ、Ⅳ期（３４．１％），Ｐ＜０．０５；无淋巴 结转移的病例ｐ１６基因ｍＲＮＡ阳性率（７３．３％）高于有淋巴结转移的病例（３３．３％），Ｐ＜０．０５；高、 中分化病例组ｐ１６基因ｍＲＮＡ表达阳性率（５４．５％）与低分化病例组（４４．０％）之间差异无显著性 （Ｐ＞０．０５）。结论ｐ１６基因的异常改变可能参与了非小细胞肺癌发生发展过程，ｐ１６基因ｍＲＮＡ 的表达检测作为一种辅助指标。 【关键词】 肺癌；ｐ１６基因； 逆转录一多聚酶链反应 ｐ１６ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｏｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｚＨＡＮＧ Ｊｕｎ—ｈａｎｇ ．ＭＡ Ｌｉｎ。 ＬｊＵ —ｔｏｎｇ，ｅｔ ａ１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００１，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ），ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｂｅｎｉｇｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ｐｌ６ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｄｅ— ｔｅｃｔａｂｌｅ ｉｎ ９４．２％ｎｏｒｍａ１ ｔｉｓｕｅｓ．ｗｈｉｌｅ ５０．７％ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｕｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （Ｐ＜０．ｏ５）；ｐ１６ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ４６．０％ｏｆ ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）；ｐ１６ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ Ｉ，１Ｉ ａｎｄ ｎｏ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（Ｐ＜０ ０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈａｓ ａ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｌｙｍｐｔｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；Ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ，ｐ１６ ｍａｙ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ—ｓｍａｌ１ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎ— ｅｅｌｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｐ１６ ｇｅｎｅ； ＲＴ—ＰｃＲ 癌基因和抑癌基因的异常改变可促使支气管上皮 化４４例，低分化１９例，未分化癌６例；有纵隔淋巴结 细胞转化为恶性肿瘤细胞…。已发现与肺癌相关的 转移者３９例，无者３０例。肺良性疾病包括结核１０ 抑癌基因有Ｒｂ、ｐ５３、ｐ１６、ｒｉｍ２３等＿２．３ Ｊ。ｐ１６基因是一 例、炎性假瘤７例、支气管扩张症４例。全部病例术后 种非常重要的抑癌基因，在细胞周期中起重要作 均经病理确诊。组织标本离体后迅速放入液氮中。后 用。我们采用逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）的方法 转入一８０℃冰箱保存。所有患者术前均未经化疗或 研究肺癌组织中ｐ１６基因ｍＲＮＡ表达及其临床意义。 放疗等抗癌治疗。 材料与方法 ２．试剂：Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒（美国Ｉ ｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏＩｏｇｉｅｓ公 司）；ＰＣＲ扩增试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司），ＲＴ—ＰＣＲ扩增 １．研究对象６９例肺癌和２１例肺良性病变组织标 引物由宝生物工程（大连）有限公司合成并纯化。顺序 本取自辽宁省肿瘤医院。肺癌病例中男４６例，女２３ 为：ｐｌ６Ｆ：５’一ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣ一３’：ｐｌ６Ｒ： 例，平均年龄５６岁。其中非小细胞肺癌６３例。小细胞 ５’一ＣＧＡＧＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴ一３’。 肺癌６例；Ｉ～Ⅱ期２８例，Ⅲ～Ⅳ期４１例；高～中分 ３．提取组织总ＲＮＡ：按ＴＲＩＺＯＩ 试剂盒说明书所 述方法进行。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０１００１０４）；辽宁省博士启 动基金资助课题（２００１１０２０３７） ４．反转录合成ｃＤＮＡ第１链反应体系：Ｏｌｉｇｏ（ａＴ） 作者单位：ｌ１０００１沈阳，中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验 引物１ ｔ，ｌ，随机６核苷酸引物１ Ｉ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混 室（张军航、刘芙蓉）；中国医科大学附属第二医院妇产科（马琳）；中国 合液１ ｔ＊ｌ，总ＲＮＡ ７ Ｉ。６５℃５ ｍｉｎ，冰中放置１ ｍｉｎ 医科大学附属第一医院胸外科（）；中国协和医科大学基础医学院 后加入１０×ＲＴ缓冲液２ ｔＡ，２５ ｍｍｏｌ／Ｉ ＭｇＣ１２ ４ Ｉ， 医学遗传研究室（张学） ４６５ ０ １ ｍｏＩ／Ｌ ＤＴＴ ２ ｌ。ＲＮＡ酶抑制剂１ １，混匀后置 ２ｓ℃孵育２ｍＩＩｌ１加１ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ反转录酶， ２５℃孵育１０ｍｉｎ后转至４２℃继续孵育５０ｍｉｎ，７０℃ 加热１５ ｍｉｎ．一２Ｏ℃冻存备用： ｓ４ ５％（２４／４４），低分化病例阳性率为２６ ３％（５／１９） 两者间差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。 ５ ＰＣＲ扩增总反应体系１０ ｌ。１０×Ｂｕｔ＂ｆｅｒ ＰＣＲ 缓冲液Ｌ Ｉ』Ｉ，２．５ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混台液０ ８ Ｉ．１０ ｍｏｌ／Ｌ引物各Ｏ．２ ｌ，反转录产物１ ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚 台酶０．０５ Ｉ，Ｈ２Ｏ ６ ８ ｌ。反应条件：９５℃３ｍ［ｎ ３０ Ｓ 预变性．然后９４℃５Ｏ ｓ，５５℃１ ｍｉｎ，７２℃ｌ ｍｉｎ，共３５ 个循环，景后７２℃延仲５ｒａｉｎ。Ｇ３ＰＤＨ为对照，１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ＰＩｕｓ作为分子量标准。扩增后取ＰＣＲ产 物５ 进行２％琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭０ ５ Ｉ ）检测，Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ凝胶成像系统照相＝ ６．统计学方法：计数资料两样本率的比较采用 或Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ确切概率法检验。 结 果 １肺癌组织、癌周正常肺组织及肺良性疾病组织 ｐｌ６基因ｍＲＮＡ的表达：２１例啼良性疾病ｐ１６基围 ｍＲＮＡ均为阳性表达；肺癌组织ｐｌ６基因ｍＲＮＡ阳性 率为ｓ０．７％（３５／６９）．癌周正常肺组织阳性率为 ９４．２％（６５／６９）；癌周正常肺组织、肺良性疾病组织 ｐ１６基因ｍＲＮＡ阳性率均高于肺癌组织．差异有显著 性（Ｐ＜０ ０５），见图１，２。 Ｈ ｆ Ｔ Ｎ ｌ Ｎ Ｔ Ⅵ ｊ２ 】 Ｎ：堪Ｊ割正常肺组织；Ｔ：肺艇坦织；Ｍ：丹子繁标记； 所有正常和呻磨纽缨均宵Ｇ３ＰＤＨ扪表选 图１ ＲＴ．ＰＣＲ １盘测肺癌组织中ｐ１６基因 表达的时吼（Ｇ３ＰＤＨ的表选） ２．ｐ１６基因ｍＲＮＡ的表达与肺癌临床病理参数 的关系：小细胞肺癌Ｐｌ６基因ｍＲＮＡ阳性率为１００％ （６／６），高于非小细胞肺癌的４６ ０％（２９／６３），两者之 间的差异有显著性（Ｐ＜０ ０５）；临束Ｉ～Ⅱ期ＤＩ６基 因ｍＲＮＡ表达阳眭率为７５．０％（２１／２８）．高于Ⅲ～Ⅳ 期的３４．１％（１４／４１），两者之间的差异有显著性（Ｐ＜ ０．０５）；无纵隔淋巴结转移病例组中Ｉ］１６基因ｍＲＮＡ 阳性率为７３ ３％（２２／３（３），高于伴有纵隔淋巴结转移 组的３３．３％（１３／３９），两者之间的差异育显著性（Ｐ＜ ０ ０５）；高～中分化病例Ｐ１６基幽ｍＲＮＡ阳性率为 Ｎ：癌周正常肺组鳃；Ｔ：肺癌组织；Ｍ：分子量｝示记； 病例１ ２：Ｉｔ￣瘸组织中ｍＲＮＡ丧达缺失；病例３：Ⅱ出 瘸组织ｍＲＮＡ表选正常；扁倒４：肿瘤组织中ｍＲＮＡ 表选略减弱 图２ ＲＴ ＰＣＲ橙测肺癌组织中ｐｌ６基因ｍＲＮＡ表选 讨 论 细胞周期素（ｃｙｄｉｎｓ）一细胞周期素依赖性蛋白激 酶（ＣＤＫｓ）一细胞周期素依赖激酶抑制蛋白（ＣＫＩｓ） 系统在细咆周期中起重要作用 本研究结果显示，肺癌组织ｐ１６基幽ｍＲＮＡ阳性 率（５（）１＿７％）明显低于癌周正常肺组织（９４．２％）及肺良 性疾病（１００ ０％），非小细胞肺癌阳性率（４６．０％）明显 低于小细胞肺癌（１００．０％），园此提示ｐ１６基因的表达 缺失可能参与了肺癌的发生过程，并具有明显的组织 学类型特异性，ｐｌ６基因的异常可能更多涉及非小细 胞肺癌的发生。Ｐ】６基因ｍＲＮＡ表达的缺失，导致其 不能翻译成有功能的蛋白产物、从而 【起细咆的恶性 转化 通过对ｐ１６基因的表达缺失与临床关系的研 究．我们发现，临床Ⅲ～Ⅳ期病例的ｐ１６基因ｍＲＮＡ 表达阳Ｉ生率（３４．１％）明显低于临床Ｉ～Ⅱ期 （７５ ０％）；有纵隔淋巴结转移病悄组（３３ ３％）明显低 于无纵隔淋巴结转移病例组（７３．３％）．此结果提示 ｐｌ６基因表达的异常与肺癌的进展有关。Ｐ１６基因 ｍＲＮＡ表达的缺失常发生在临床晚期或已发生纵隔 淋巴结转移的病例中．因此，临床上通过检测Ｄ１６基围 ｍＲＮＡ表达对肺癌患者预后的判断可起辅助作用， ｐｌ６基因ｍＲＮＡ表述阴性的患者预后较差 参考文献 Ｆｒａｄｅ Ｒ Ｂａ［ｂｏ Ｍ．Ｂａｒｅ！Ｍ ＲＢ１８Ａ ｒ罐ｕ Ｉ瞄ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｍｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ （）ｎｃｏｇｅｎｅ．２００２．２１：８６ｌ ８６６ ２ Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ．Ｙａｍａｓｈ…Ｋ Ｌ…ｍｙｃ ｔｒｉｃ㈨ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇ：ｈ ｐｏｌｘ￣ｔｏｒ－ ｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａａｅｍ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒ￣ｎｏｍａ Ｏｎｃｏｉ Ｒｅｐ，２００２．９：３４５ ３４７ ３ Ｍｅｕ，ｖｉｓｓ￣ｒ＊Ｒ．Ｌｍｎ ．Ｖａｎ ６ｅｒ Ｖａｌｋ Ｍ．ｎ ａｉ Ｍｏｕｓｅ ｍ，ｘ￣ｄｆｏｒｌｕｎｇ ｎ…ｇ…ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｒ Ｉｏｘ ｃｏｍｒｏｉｌｅｄ ｓ ａｄ ［ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ０ｆ：ｈｅ Ｋ Ｒ ｓ ｏ￣ｃｏｇｅｎｅ Ｏｎ￣ｇｅｎｅ．２（３０１，２０：６５５１ ｕ６５５８ （收稿口期：２０１３３ １１．１１）
