大理学院学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ 第１２卷第６期２０１３年６月 Ｖ０Ｊ．１２ Ｎｏ６ Ｊｕｎ． ２０】３ ［ＤＯＩ］１０．３９６９／＿ｉ＿ｉｓｓｎ．１６７２—２３４５．２０１３．０６．０１１ 单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较 张垣榕，颜 军，李文龙，侯敏，蒋玉佳，卜 舒，李桂满 （昆明市疾病预防控制中心，昆明 ６５０２２８） ［摘要］目的：通过比较国标法、ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法￣ＺＬＡＭＰ方法，得到适合基层实验室快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方 法：分别用国标法、ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法和环介导的等温扩增（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）法检测李斯特菌，并进 行方法比较。结果：三种方法对单增李斯特菌的检测结果一致．国标法整个检测过程需５～７ ｄ；ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法实验条件要求高， 成本高，检测需１．５－２．５ ｄ；ＬＡＭＰ法实验条件低，成本低，检测时限与ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ相同。结论：ＬＡＭＰ法检测单增李斯特菌灵敏度 高、特异性强、快速高效和低成本，适合基层实验室应急检测和现场监测使用。 ［关键词］国标法；ＬＡＭＰ；ＰＣＲ；单核细胞增生李斯特菌检测 ［中图分类号］Ｒ１５５．５［文献标志码］Ａ［文章编号］１６７２—２３４５（２０１３）０６—００３８—０５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺＨＡＮＧ Ｘｕａｎｒｏｎｇ，ＹＡＮ Ｊｕｎ，ＬＩ Ｗｅｎｌｏｎｇ，ＨＯＵ Ｍｉｎ，ＪＩＡＮＧ Ｖｕｊｉａ，ＢＵ Ｓｈｕ，ＬＩ Ｇｕｉｍａｎ （Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２８，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｆｎｄ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）ｉｎ ｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ ｌａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ： ＧＢ ｌａｗ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＬＭ，ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｏｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＧＢ ｌａｗ ｔｏｏｋ ５ ｔｏ ７ ｄａｙｓ．Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｔｏｏｋ ２．５ ｄａｙｓ．ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｌｏｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｓｔ，ｔｏｏｋ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ａｓ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＭ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｂｙ ｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ ｌａｂｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｊ ＧＢ ｌａｗ；ＬＡＭＰ；ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 单核细胞增生李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ， 污染是食品安全的重要保障之一。 ＬＭ的鉴定方法有国标的分离鉴定法、免疫学鉴 定法、ＰＣＲ法等。分离培养鉴定法较简单，但操作繁 琐，鉴定过程需要５～７ ｄ，检出限较低，费时费力，难 ＬＭ）是一类兼性细胞内生长的革兰阳性杆菌，致病 力较强，可引起人畜李斯特病，临床表现为败血症、 脑膜炎、单核细胞增多和胃肠炎，主要通过污染的 肉类、乳制品和蔬菜等引起李斯特菌感染。国内外 以满足突发事件的快速检测要求。免疫学鉴定法由 于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在，难以进行李斯 特菌种问的特异性鉴别［３］３。ＰＣＲ法具有特异性强、灵 对单增李斯特菌高度重视，１９８６年ＷＨＯ已将其列 为食品四大致病菌之一，２０００年在ＷＨＯ食品安全 工作计划中，已将该菌列为重点检测的食源性致病 菌之一［１］。最近，美国从２０１１年７月３１日出现首例李 敏度高和反应速度快的优点，但需要昂贵的ＰＣＲ仪， 且检测成本高，不适宜基层实验室使用。由Ｎｏｔｏｍｉ 等［ 在２０００年设计的ＬＡＭＰ法是一种恒温核酸扩增 方法，该方法是通过４条特异性引物识别靶基因的６ 个区域和具有链置换活性的Ｂｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 斯特病病例报告至同年ｌ２月８日，共报告病例１４６例， 死亡３Ｏ例，这是１０多年来美国最严重的一起食源性 疾病暴发事件 。所以及时有效的控制食品中ＬＭ的 ３８ 总第１１４期 张炬榕，颜军，李文龙，等单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较 第１２卷 ｓｔｅａｒ０ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡ聚合酶作用，在６５℃的恒温 接种于ＰＡＬＣＡＭ平板和李斯特氏显色培养基３６℃培 条件下扩增。与ＰＣＲ不同，ＬＡＭＰ不需要精密的ＰＣＲ 养２４ ｈ，取菌落分别接种在木糖和鼠李糖发酵管 仪和昂贵的试剂［５］，尤其适合在缺乏设备支持的基 ３６℃培养２４ ｈ，同时在ＴＳＡ—ＹＥ上纯化３０℃培养 层实验室和突发现场开展检测工作。本实验通过同 时应用国标的分离鉴定法，ＰＣＲ法和ＬＡＭＰ法检测鉴 定ＬＭ来比较ＬＡＭＰ方法在ＬＭ检测中的高效性、准确 性和可靠性。 ２４ ｈ，选择木糖阴性、鼠李糖阳性的菌继续进行全自 动生化鉴定６～７ ｈ，并依次进行动力试验、生化鉴定 和溶血试验。 １．３．２ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法取培养２４ ｈ的ＬＢ２增菌液 ｌ材料与方法 １．１菌株实验室保存的李斯特菌１１株。 单增李斯特菌检测试 １．２主要试剂和仪器设备１ ｍＬ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 ５，２ ｒａｉｎ，弃上清，加入８Ｏ Ｌ ＤＮＡ提取液混匀煮沸裂解１０ ｍｉｎ，置冰上１０ ｍｉｎ， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｍｉｎ，上清即为模板。按试剂盒说 剂盒（荧光ＰＣＲ法）购自深圳易瑞生物技术有限公 司；单核细胞增生李斯特氏菌核酸检测试剂盒（环介 导恒温扩增法）购自广州华峰生物科技有限公司；琼 脂购自基因公司；１００００￣ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ购自北京优 明书准备反应体系，分别取５ 阴性、阳性质控品 和提取的ＤＮＡ￣Ｉ入反应体系中。循环参数：预变性 ９５℃１０ ｍｉｎ，１次循环；变性９５℃１０ Ｓ，退火、延伸 及检测荧光５８℃４５ Ｓ，４０次循环。 尼康生物科技有限公司；全自动微生物生化鉴定仪 （ＶＩＴＥＫ３２）；上海一恒恒温水浴锅；ＢＩＯ—ＲＡＤ凝胶成 １．３＿３ ＬＡＭＰ法菌株ＤＮＡ提取参见ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ 法。根据试剂盒说明书分别取２．５ 阴性、阳性质控 像系统；北京八一六厂电泳仪。 ｌ－３方法 品和提取的ＤＮＡ￣［１人反应体系中，置６５℃６０ ｍｉｎ。 １．４结果判定 １．３．１ 国标法根据食品安全国家标准《食品微生 物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》 ＧＢ４７８９．３０—２０１０分离鉴定菌株。李氏增菌肉汤ＬＢ１ ３０℃培养２４ ｈ，转种李氏增菌肉汤ＬＢ２ ３０ ｏＣ培养２４ ｈ， １．４．１ 国标法ＶＩＴＥＫ３２直接判读结果后，进行后 续的生化试验鉴定。所用李斯特菌株生化反应特征， 见表１。 表１ 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别 注：“＋”表示阳性，“一”表示阴性，“ｖ”表示反应不定。 １．４．２ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法阳性结果呈现典型的Ｓ型 结果，不产生条带为阴性结果。 扩增曲线。ｃｔ值Ｉ＞３８或ｕｎｄｅｒ为阴性结果，ｃｔ值＜３５为 阳性结果，３５≤ｃｔ值＜３８为检测灰区，重复测定两次， 两次测定ｃｔ值≥３８为阴性结果，其中一次ｃｔ值＜３８为 阳性结果。 ２实验结果 ２．１国标法检测１ｌ株李斯特菌中７株为ＬＭ，３株 为英诺克李斯特菌，ｌ株为伊氏李斯特氏菌，见表２。 １１株李斯特菌４株从速冻熟制米面制品中分离，３株 从熟肉制品中分离，２株从即食非发酵性豆制品中分 离，１株为省疾控下发质控，ｌ株为国家临检中心下发 考核样。其中，检出７株ＬＭ中除１株为省疾控下发质 ３９ １．４．３ ＬＡＭＰ法 肉眼观察产物颜色变化，出现绿 色判定为阳性，橙色为阴性。扩增产物在１．５％琼脂 糖凝胶上进行电泳，有不同大小的梯形条带为阳性 总第ｌ１４期医学 大理学院学报 控样外，其余为２株从速冻熟制米面制品中分离，２株 从熟肉制品中分离，２株从即食非发酵性豆制品中分 别是加工后即食的食品。 ２．２ ｒｅａｌ～ｔｉｍｅ ＰＣＲ法采用针对目标菌为ＬＭ的荧 离；３株英诺克李斯特菌中１株从熟肉制品中分离，２ 光ＰＣＲ法分别对１ １株实验菌株核酸进行扩增，其中 株从速冻熟制米面制品中分离；１株伊氏李斯特菌是 国家临检中心下发考核样，见表２。说明李斯特菌对 环境要求和营养要求都不高，可污染不同的食物，特 有７株菌株ＰＣＲ扩增呈现典型ｓ型扩增曲线，ｃｔ值均＜ ３５，检测结果为ＬＭ，其它４株李斯特菌为阴性，检测 结果与国标法一致，见表３。 表２国标法检测结果 菌株编号 国标法 Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法ＬＡＭＰ法 注：“＋”表示检出ＬＭ；“一”表示未检出ＬＭ。 ４０ 总第１１４期医学 验环境下为食品安全突发事件提供快速的病原学的 初步检测依据。 综上所述，通过对三种检测鉴定方法的结果比 较可知ＬＡＭＰ法检测ＬＭ是三种检测法中较简便和快 速的方法，与其它核酸扩增技术相比，具有实验操作 简单、快速、成本低、对设备条件要求低等方面的优 势。其特异性强、灵敏度高、快速高效和产物鉴定简 便的优点，适合县区级疾病预防控制中心快速检测 和现场监测等应用。 ［参考文献］ ［１］严剑波，王虹玲，朱水荣，等．单增李斯特茵ＬＭＡＰ方法的 建立［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００９，１９（９）：２０４８—２０５０． ［２］Ｍｕｌｔｉｓｔａｔｅ Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｉｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｗｈｏｌｅ Ｃａｎｔａｌｏｕｐｅｓ ｆｒｏｍ Ｊｅｎｓｅｎ Ｆａｒｍｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ［ＥＢ／ＯＬ］． ［２０１１—１１－０８］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇ０ｖ／ｌｉｓｔｅｒｉａ／０ｕｔｂｒｅａｋｓ／ ｃａｎｔａｌｏｕｐｅｓ－ｊｅｎｓｅｎ－ｆａｒｍｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ１． ［３］巢国祥，周晓辉，焦新安．单核细胞增生性李斯特茵ＰＣＲ快 速检测方法的建立及应用［Ｊ］．中国人兽共患病杂志，２００４， ２０（９）：７９７—８００． ［４］Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ￣Ｊ ３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０００，２８（１２）：Ｅ６３． 大理学院学报 （５］肖斌，朱永红，邹全明．简便敏感的环介导等温扩增基因 诊断新技术（Ｊ］．中华检验医学杂志，２００５，２８（７）：７６１— ７６３． ［６］Ｍａｒｕｙａｍａ Ｆ，Ｋｅｎｚａｋａ Ｔ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｘ２ Ｇｅｎｅ ｂｙ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ）．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３， ６９（８）：５０２３—５０２８． （７］Ｓｏｎｇ Ｔ，Ｔｏｍａ Ｃ，Ｎａｋａｓｏｎｅ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｉｎ ｖａｓｉｖｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ａ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ ３． ＦＥＭＳ Ｍｉｅｒｉｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２００５，２４３（１）：２５９—２６３． ［８］Ｙｕｋｉｋｏ Ｈ Ｋ，Ｎｅｍｏｔｏ Ｊ，Ｏｈｔｓｕｋａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，５６：３９８－４０６． ［９］侯敏，颜军，张煌榕，等．环介导等温扩增技术检测技术检 测志贺氏茵的研究（Ｊ］．云南预防医学杂志，２０１２，１７（２）： ２８－３１ ［收稿日期］２０１２—０９—１６ ［修回日期］２０１２—１０—１６ ［作者简介］张煊榕，初级检验师，主要从事病原生物检验研究 （责任编辑李杨）
