一种细胞保存液[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107926933 A(43)申请公布日 2018.04.20

(21)申请号 201810033012.2(22)申请日 2018.01.14

(71)申请人 上海赛立维生物科技有限公司

地址 201203 上海市浦东新区张江高科技

园区碧波路518号211B(72)发明人 鄢和新　杨秋蕊　翟志敏　吴红平　

唐为忠　翟博　(74)专利代理机构 上海恒锐佳知识产权代理事

务所(普通合伙) 31286

代理人 黄海霞(51)Int.Cl.

A01N 1/02(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图1页

(54)发明名称

一种细胞保存液(57)摘要

本发明提供一种细胞保存液，包括以下组分：30-120mM渗透压稳定剂、2-6mM糖类物质、0-10mM还原剂、0-120mM电解质溶液、25-60mM氨基酸；所述细胞保存液的渗透压为310-350mOsm/L。本发明的细胞保存液在低温条件下，能够有效降低细胞代谢，减少低温损伤，方便了活细胞在运输过程中的保存，也方便了机构短期保存有功能的活性细胞。

CN 107926933 ACN 107926933 A

权　利　要　求　书

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1.一种细胞保存液，其特征在于，包括以下组分：30-120mM渗透压稳定剂、2-6mM糖类物质、0-10mM还原剂、0-120mM电解质溶液、25-60mM氨基酸；所述细胞保存液的渗透压为310-350mOsm/L。

2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述电解质溶液包含：1-20mM Na+、20-120mM K+、7-15mM Mg2+、0-0.25mM Ca2+。3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的细胞保存液，其特征在于，所述氨基酸选自组氨酸和谷氨酸；所述组氨酸的含量为25-60mM，所述谷氨酸的含量为15-40mM。

5.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇和/或乳糖酸。

6.根据权利要求5所述的细胞保存液，其特征在于，所述甘露糖醇的浓度为30-80mM，所述乳糖酸的浓度为30-120mM。

7.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述糖类物质为葡萄糖和/或果糖。8.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述还原剂选自α-酮戊二酸、谷胱甘肽、维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸、叔丁基氢醌中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的细胞保存液，其特征在于，所述α-酮戊二酸的浓度为0.5-2mM，所述谷胱甘肽的浓度为3-6mM，所述维生素C的浓度为1-10mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为0-5mM，所述叔丁基氢醌的浓度为1-10μM。

10.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液中还包含0.1-10mM能量底物。

11.根据权利要求10所述的细胞保存液，其特征在于，所述能量底物选自腺嘌呤、腺苷、还原型谷胱苷肽中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的细胞保存液，其特征在于，所述能量底物为腺苷。13.一种细胞保存方法，其特征在于，采用权利要求1至12中任一项所述细胞保存液保存细胞。

14.根据权利要求13所述细胞保存方法，其特征在于，所述细胞为干细胞或免疫细胞。15.一种组织保存方法，其特征在于，采用权利要求1至12中任一项所述细胞保存液保存组织。

16.根据权利要求1至12任一项所述的细胞保存液在细胞保存中的应用。17.根据权利要求16所述细胞保存液在细胞保存中的应用，其特征在于，所述细胞为干细胞或免疫细胞。

18.根据权利要求1至12任一项所述的细胞保存液在组织保存中的应用。19.根据权利要求18所述的细胞保存液在组织保存中的应用，其特征在于，所述组织为肝组织、肺组织、肾组织、肝癌旁组织、胆管癌组织、肝癌组织、肺癌组织或卵巢。

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说　明　书一种细胞保存液

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技术领域

[0001]本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种细胞保存液及其应用。

背景技术

[0002]细胞是生物体的基本结构单位，细胞质量将影响着身体状态。细胞广泛应用于科研和临床上，其应用的关键是大量供体细胞的获得和免疫排斥反应的克服，大量供体细胞的获得主要靠体外细胞培养和保存来解决。[0003]目前，细胞保存还存在一些问题，如运输不便，临时储存不便，运输过程中细胞活性下降快，细胞容易积聚成团等。细胞长时间运输后细胞的活率很低，细胞大量死亡，直接影响临床效果。因此，在临床医疗中，如何维持细胞活性是一项极大的挑战，在短时间内保存细胞时，往往使用生理盐水或者细胞培养基来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低速度非常快，细胞在培养液中保存效果也不理想，难以高效保存细胞生物活性。[0004]目前细胞低温保存液大多借鉴和采用器官/组织低温保护液和灌洗液，例如HTK液、UW液、Collins液等。这些保护液和灌洗液基础成分比较简单，多为1960-1970年代发明，后来，为适用于不同器官/组织的需要，又经过各种改良，可以保存器官10-72小时。这些改良后的保护液和灌洗液现在可用于低温保存细胞，但是保存细胞与保存器官/组织的需求不同，细胞在低温保存液中容易发生以下生理改变：缺乏天然细胞外结构和物质，易发生细胞膜膨胀；更多环境压力造成氧化损伤，生成大量脂质过氧化物，细胞保存液变酸；过多的生长因子和营养提高细胞基础代谢率，生成更多的代谢产物，这些代谢产物堆积进一步有害细胞活性。这些特点导致低温保存的细胞非常容易受到细胞外环境影响，例如细胞保存液的渗透压、离子浓度、能量底物、抗凋亡和抗坏死物质。因此，针对细胞的低温生物学特征，发明一种优化的低温细胞保存液是必要的。

[0005]专利公开号为CN104542578B的发明专利公开了一种细胞保护液，该细胞保存液包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物。在0～4℃条件下，间充质干细胞和免疫细胞在该细胞保存液中保存48h，活力能够保持在90％以上，形态也没有出现变化。但是该保存条件下，细胞长时间保存会使细胞活性发生退化，并且不能满足大规模保存需求。发明内容

[0006]针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种细胞保存液，有效延长了细胞保存时间，提高了保存效果，高效维持活性细胞的低温存活。[0007]本发明的第一方面是提供一种细胞保存液，包括以下组分：30-120mM渗透压稳定剂、2-6mM糖类物质、0-10mM还原剂、0-120mM电解质溶液、25-60mM氨基酸；所述细胞保存液的渗透压为310-350mOsm/L。

[0008]本发明所述细胞保存液，其有益效果在于：有效延长了细胞保存时间，提高了保存效果。

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进一步地，所述电解质溶液包含：1-20mM Na+、20-120mM K+、7-15mMMg2+、0-0.25mM 

Ca2+。所述电解质溶液中，盐离子的浓度模拟细胞内液，采用低浓度Na+、高浓度K+、高浓度Mg2+、低浓度Ca2+，可降低细胞膜表面离子泵活性，减少酸性物质产生。[0010]进一步地，所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的至少一种。优选地，所述氨基酸选自组氨酸和谷氨酸；所述组氨酸的含量为25-60mM，所述谷氨酸的含量为15-40mM。采用所述氨基酸作为pH缓冲剂，缓冲能力强，能有效防止溶液变酸；加入所述谷氨酸可被细胞合成谷氨酰胺，谷氨酰胺可进一步被合成为谷胱甘肽，也可清除代谢产生的氧化自由基。[0011]进一步地，所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇和/或乳糖酸。所述渗透压稳定剂能够有效保持细胞稳定性。[0012]进一步地，甘露糖醇的浓度为30-80mM，所述乳糖酸的浓度为30-120mM。[0013]进一步地，所述糖类物质为葡萄糖和/或果糖。采用葡萄糖、果糖等糖类物质能够作为能量底物提供能量，低温时，细胞代谢降低，提供少量能量底物有助于细胞维持最低代谢；若缺乏，细胞会因缺少能量而活性不好，不能长时间保存；若过量，会无氧糖酵解引起溶液酸化。

[0014]进一步地，所述还原剂选自α-酮戊二酸、谷胱甘肽、维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸、叔丁基氢醌中的至少一种。所述还原剂能够清除氧化自由基和铵离子，减少氧化损伤。[0015]进一步地，所述α-酮戊二酸的浓度为0.5-2mM，所述谷胱甘肽的浓度为3-6mM，所述维生素C的浓度为1-10mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为0-5mM，所述叔丁基氢醌的浓度为1-10μM。

[0016]进一步地，所述细胞保存液中还包含0.1-10mM能量底物。[0017]进一步地，所述能量底物选自腺嘌呤、腺苷、还原型谷胱苷肽中的至少一种。[0018]优选地，所述能量底物为腺苷。采用所述腺苷作为能量底物可用于合成磷酸腺苷，维持细胞ATP水平，保持细胞的生理活动。[0019]进一步地，所述细胞保存液用于保存细胞时的保存温度为0-10℃；优选地，所述细胞保存液用于保存细胞时的保存温度为2-8℃。

[0020]本发明的另一方面在于提供一种细胞保存方法，包括采用上述细胞保存液保存细胞。

[0021]进一步地，所述细胞选自干细胞或免疫细胞。[0022]本发明的另一方面在于提供一种组织保存方法，包括采用上述细胞保存液保存组织。

[0023]本发明的另一方面在于提供上述细胞保存液在保存细胞中的应用；优选地，所述细胞为干细胞或免疫细胞。

[0024]本发明的另一个方面在于提供上述细胞保存液在保存组织中的应用；优选地，所述的组织为肝组织、肺组织、肾组织、肝癌旁组织、胆管癌组织、肝癌组织、肺癌组织或卵巢。[0025]本发明的有益效果如下：[0026](1)本发明采用氨基酸作为pH缓冲剂，缓冲能力强，能有效防止溶液变酸。[0027](2)本发明所述细胞保存液中加入所述谷氨酸可被细胞合成谷氨酰胺，谷氨酰胺可进一步被合成为谷胱甘肽，也可中和代谢产生的酸性物质。

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(3)本发明所述细胞保存液采用所述甘露糖醇和/或乳糖酸作为渗透压稳定剂能

够保持细胞膜稳定性。[0029](4)本发明所述细胞保存液采用所述葡萄糖、果糖等糖类物质能够作为能量底物提供能量，低温时，细胞代谢降低，提供少量能量底物有助于细胞维持最低代谢；若缺乏，细胞会因缺少能量而活性不好，不能长时间保存；若过量，会无氧糖酵解引起溶液酸化。[0030](5)本发明所述细胞保存液采用所述腺苷作为能量底物可用于合成磷酸腺苷，保持细胞的生理活动。[0031](6)本发明所述细胞保存液采用所述α-酮戊二酸、谷胱甘肽、维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸、叔丁基氢醌等还原剂能够清除氧化自由基和铵离子，减少氧化损伤。[0032](7)本发明所述细胞保存液采用的所述电解质溶液中，盐离子的浓度模拟细胞内液，采用低浓度Na+、高浓度K+、高浓度Mg2+、低浓度Ca2+，可降低细胞膜表面离子泵活性，减少酸性物质产生。

附图说明

[0033]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0034]图1显示了不同细胞保存液对骨髓间充质干细胞增殖的影响。[0035]图2显示了不同细胞保存液对不同组织活性的影响。

具体实施方式

[0036]除非另作定义，本发明权利要求书和说明书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。[0037]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对本发明要求保护的范围不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0038]下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

[0039]试剂：

[0040]DMEM/F-12培养基为ThermoFisher Scientific公司生产，产品编号为：10565042；[0041]胎牛血清为Biological Industries公司生产，产品编号为：04-001-1A；[0042]Cell Counting Kit-8，即CCK-8为Dojindo Laboratories公司生产，产品编号为：CK04；

[0043]胰酶为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为：S330JV；[0044]仪器：

[0045]96孔细胞培养板为Corning公司生产，产品编号为：#3599；

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12孔细胞培养板为Corning公司生产，产品编号为：#3513。

[0047]本申请的发明人经过广泛而深入地研究发现，现有技术的细胞保存液保存细胞时间不够长，在细胞运输过程中损失细胞数量较多，并且，细胞增殖状况受到影响。[0048]在此基础上，为了达到高效维持活性细胞的长时间低温存活，本发明提出的细胞保存液采用了氨基酸缓冲剂、低含量的糖类物质以及与细胞内液近似的离子配比，在细胞低温保存过程中起到有效防止溶液酸化的作用。采用了天然的渗透压稳定剂及略高于血浆的渗透压，在细胞低温保存过程中起到防止细胞膜膨胀的作用。采用多种还原剂能够减少细胞在低温保存过程中细胞的环境压力和氧化损伤。也可以加入腺苷作为能量底物从而维持细胞ATP水平，维护细胞各种生理活动。还可以加入谷氨酸，谷氨酸可进一步被合成为谷胱甘肽，也可清除代谢产生的氧化自由基。[0049]本发明的细胞保存液包含以下组分：30-120mM渗透压稳定剂、2-6mM糖类物质、0-10mM还原剂、0-120mM电解质溶液、25-60mM氨基酸；所述细胞保存液的渗透压为310-350mOsm/L。

[0050]所述电解质溶液包含：1-20mM Na+、20-120mM K+、7-15mM Mg2+、0-0.25mM Ca2+。[0051]本实施例中，所述电解质溶液包含：15mM NaOH、25mM KH2PO4、85mM KOH、13mM MgCl2、0.25mM CaCl2。本发明一些实施例中所述Na+浓度为1mM、10mM、18mM或20mM；所述K+浓度为20mM、40mM、60mM、80mM、100mM或120mM；所述Mg2+浓度为7mM、10mM或15mM；所述Ca2+浓度为0mM、0.1mM或0.2mM。

[0052]所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的至少一种。优选地，所述氨基酸选自组氨酸和谷氨酸，所述组氨酸的含量为25-60mM，所述谷氨酸的含量为15-40mM。[0053]本实施例中所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸，所述组氨酸的浓度为30mM，所述谷氨酸的浓度为20mM。在本发明一些实施例中，所述组氨酸的浓度为25mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM；所述谷氨酸的浓度为15mM、25mM、30mM、35mM或40mM。[0054]所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇和/或乳糖酸。

[0055]本实施例中所述渗透压稳定剂为甘露糖醇和乳糖酸，所述甘露糖醇浓度为60mM，所述乳糖酸的浓度为80mM。本发明一些实施例中，所述渗透压稳定剂为甘露糖醇或乳糖酸；所述甘露糖醇浓度为30mM、40mM、50mM、60mM、70mM或80mM；所述乳糖酸浓度为30mM、50mM、70mM、90mM或120mM。

[0056]所述糖类物质为葡萄糖和/或果糖。

[0057]本实施例中所述糖类物质为葡萄糖和果糖，所述葡萄糖浓度为5mM，所述果糖浓度为5mM。本发明一些实施例中，所述糖类物质为葡萄糖或果糖，所述葡萄糖浓度为2mM、4mM或6mM，所述果糖浓度为2mM、4mM或6mM。[0058]所述还原剂选自α-酮戊二酸、谷胱甘肽、维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸、叔丁基氢醌中的至少一种；所述α-酮戊二酸的浓度为0.5-2mM，所述谷胱甘肽的浓度为3-6mM，所述维生素C的浓度为1-10mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为0-5mM，所述叔丁基氢醌的浓度为1-10μM。

[0059]本实施例中所述还原剂包含组分及浓度为：1mMα-酮戊二酸、3mM谷胱甘肽、1mM维生素C、5mM N-乙酰-L-半胱氨酸、5μM叔丁基氢醌。

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所述细胞保存液中还包含0.1-10mM能量底物。

[0061]所述能量底物选自腺嘌呤、腺苷、还原型谷胱苷肽中的至少一种。[0062]本实施例中所述能量底物为腺苷，所述腺苷的浓度为5mM。本发明一些实施例中，所述腺苷的浓度为0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

[0063]本发明实施例还提供了一种利用上述所述细胞保存液保存细胞的方法；所述细胞为干细胞或免疫细胞。

[00]本发明实施例提供的所述细胞保存液，能够有效提高细胞存活率，提高保存后获得细胞的增殖速度。本实施例将经过本实施例所述细胞保存液低温保存后获得的骨髓间充质干细胞与采用细胞培养基及现有技术细胞保存液低温保存后获得的骨髓间充质干细胞培养不同时间后细胞的增殖倍数进行比较，以说明上述有益效果。[0065]具体地：

[0066]准备3种细胞保存液[0067]A：本实施例所述细胞保存液；B：细胞培养基；C：UW液。其中所述细胞培养基的组分为：90％DMEM/F-12培养基、10％胎牛血清、5mΜ抗坏血酸和2mM谷氨酰胺。[0068]使用同一来源的人骨髓间充质干细胞，加入所述细胞培养基培养，待细胞生长达到对数生长期时，胰酶消化细胞，计数细胞总数；分别吸取4×105个细胞到三个离心管中，180g离心力条件下离心，除去上清液；在所述三个离心管中，分别加入4mL本实施例中所述3种细胞保存液重悬细胞；将所述三个离心管放置于2-8℃环境中保存72小时；取出所述离心管，180g离心力条件下离心，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于4mL所述细胞培养基中，以1mL/孔接种于12孔细胞培养板，放置于37℃、5％CO2培养环境中培养24h、48h和72h，用所述胰酶消化细胞，计数细胞总数，分别计算所述细胞在培养24小时、48小时、72小时后的增殖倍数，计算公式为B1＝A1/4，B2＝A2/4，B3＝A3/4，其中，A1×105表示培养24小时候细胞总数，A2×105表示培养48小时候细胞总数，A3×105表示培养72小时候细胞总数；B1表示培养24小时后所述细胞的增值倍数，B2表示培养48小时后所述细胞的增值倍数，B3表示培养72小时候后所述细胞的增值倍数。[0069]结果如图1所示，由图可以看出：在UW液中保存72小时的细胞大量死亡，增殖速度缓慢；在所述细胞培养基中保存72小时的细胞存活率较低，增殖速度较慢；在实施例所述细胞保存液中保存72小时的细胞存活量高，增殖速度最快。

[0070]本发明实施例还提供了一种利用上述所述细胞保存液低温保存组织的方法。[0071]本发明实施例提供的所述细胞保存液，能有效稳定保存不同类型组织的活性。本实施例将经过本实施例所述细胞保存液低温保存后获得的所述组织与采用细胞培养基低温保存后获得的组织进行活性比较，以说明上述有益效果。[0072]具体地：

[0073]准备2种细胞保存液[0074]A：同上述A所述细胞保存液，B：同上述B所述细胞培养基。[0075]取同一来源的新鲜的不同组织块：肝癌旁组织、正常肝组织、胆管癌组织、肝癌组织，平均分成三份，取每种组织中的一份用来检测组织细胞内线粒体脱氢酶的活力，具体处理和检测方法如下：将所述各个组织块用修剪器处理为5个均匀、统一的圆形组织片，所述圆形组织片的厚度1mm，直径为3mm。将每个圆形组织片移到第一96孔板的1个孔中，向每个

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说　明　书

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孔中加入60μL CCK-8孵育液，放入37℃、5％CO2环境中培养2小时，所述CCK-8孵育液是用DMEM/F-12培养基和CCK-8按比例5:1稀释制备得到的；然后轻轻摇匀CCK-8孵育液，每孔吸取50μL至第二96孔板中；将所述第二96孔板置于酶标仪中，测量450nm波长处的检测吸光度值，记为X0。

[0076]取所述剩余的两份组织，用修剪器处理为1×0.5×0.5cm3的组织块，将所述组织块分别浸入到5mL所述2种细胞保存液中，放于2-8℃环境中保存3天；取出，处理和检测方法同上，经本实施例细胞保存液保存后的所述各组织的吸光度值记为X1，经所述细胞培养基保存后的所述各组织的吸光度值记为X2。[0077]计算保存后组织的活性：Y1＝(X1/X0)×100％；Y2＝(X2/X0)×100％，其中，Y1表示利用本实施例所述细胞保存液保存3天后所述组织的活性，Y2表示利用所述细胞培养基保存3天后所述组织的活性。[0078]结果见图2，可以发现：与所述细胞培养基相比，本实施例所述细胞保存液能稳定保存不同类型组织的活性达70％以上，而细胞培养基的效果则不佳，为35-55％。[0079]在本发明其他优选的实施例中，将得到的组织块放于0-10℃保存3天。[0080]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

[0081]上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。[0082]虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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