湿热灭菌工艺验证指南

湿热灭菌工艺验证指南

中国医药设备工程协会

2008年12月

1

目 录

一、范围........................................................................................................................3 二、目的........................................................................................................................3 三、术语........................................................................................................................3 四、湿热灭菌基础........................................................................................................7 4.1湿热灭菌的机理..................................................................................................7 4.2影响芽孢耐热性的因素......................................................................................7 4.3湿热灭菌中的能量转移......................................................................................8 4.4湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式..................................................................9 五、灭菌法选择的基本原则......................................................................................11 六、灭菌方法的开发及选定......................................................................................12 6.1湿热灭菌方法选择决策树................................................................................12 6.2过度杀灭法........................................................................................................14 6.3残存概率法........................................................................................................14 6.4 装载类型的界定...............................................................................................15 6.5湿热灭菌对介质的要求....................................................................................16 6.5.1蒸汽..............................................................................................................16 6.5.2压缩空气......................................................................................................17 6.5.3冷却水..........................................................................................................17 七、湿热灭菌器的程序控制和记录仪表..................................................................17 7.1 WHO GMP的原则要求.....................................................................................17 7.2 技术性要求.......................................................................................................18 7.3对验证用测试仪器的要求................................................................................18 八、几种常用的湿热灭菌法......................................................................................19 8.1液体注射剂产品的灭菌....................................................................................19 8.2 多孔/固体物品的灭菌......................................................................................22 九、灭菌工艺的验证及验证文件..............................................................................24 9.1灭菌工艺验证的步骤........................................................................................24 9.2验证文件............................................................................................................26 9.3水喷淋式灭菌器验证方案示例........................................................................27 十、附表......................................................................................................................32 十一、附件-蒸汽质量测试法....................................................................................35 不凝性气体的测试..................................................................................................35 过热值测试..............................................................................................................37 干燥值测试..............................................................................................................39 十二、参考文献..........................................................................................................41

2

一、范围

由于蒸汽-湿热灭菌具备无残留，不污染环境，不破坏产品表面，易于控制和重现性好等优点，被广泛应用于注射剂的除菌过程之中。

本文旨在向有关人员提供最终灭菌药品（注射剂）的蒸汽灭菌器的确认以及蒸汽灭菌工艺验证一些带技术性的操作方法方面的指南。

本指南参照WHO GMP对无菌药品的要求及国外相关湿热灭菌的指南编写，重点放在最终灭菌药品（注射剂）的湿热灭菌工艺的验证上，其基本原则也可供冻干机干燥箱的湿热灭菌、在线蒸汽灭菌等参考。

二、目的

湿热灭菌验证的目的，就是通过一系列验证试验提供足够的数据和文件依据，获得有效合理的灭菌参数，并把经验证的湿热灭菌设备和灭菌工艺参数应用到药品生产的除菌过程中去，以证明湿热灭菌设备对被灭菌品的适用性，不同灭菌程序的可靠性和重现性，简言之，验证结果能够证明生产中所采用的灭菌工艺，能确保灭菌后被灭菌品微生物污染的残存概率低于百万分之一的要求。

湿热灭菌方式的选择，应能在保证产品理化指标、密封性能等前提下，达到我国药典通则中无菌保证的要求。任何一种灭菌程序，都必须在生产实际应用前进行验证。

三、术语

湿热灭菌程序的设计和开发，与蒸汽灭菌器的性能以及被灭菌产品的性能相关。湿热灭菌介质通常包含：饱和蒸汽，空气-蒸汽混合气体，过热水等。灭菌效果是通过蒸汽，蒸汽-空气混合物，过热水等介质与被灭菌物品的热传递来实现的。在饱和蒸汽中，温度与压力之间存在固定的关系。饱和蒸汽的加热速度较快，这是因为蒸汽在灭菌过程中相变放出了大量潜热；对于大型的软包装产品或玻璃瓶产品而言，过热水喷淋灭菌的方法应用十分普遍，在此灭菌方式中，不存在蒸汽的相变，热量的转移依赖于过热水的强制运动及与被灭菌品的直接接触。蒸汽-空气混合物灭菌中，单位体积所包含的热容量较低，灭菌腔室压缩空气和蒸汽的比例，需根据产品和所用的包装材料作必要的调整。

目前常用的脉动真空灭菌器，又称预真空灭菌器，是饱和蒸汽灭菌的一种特定方式，其基本手段是在排除灭菌腔室中影响灭菌效果的不凝气体后，再通入饱和蒸汽进行灭菌。

本指南有关湿热灭菌过程及参数的术语如下，在不同的文献中，同一术语的含义可能有所不同：

1. 初始菌（Bioburden）

又称生物负荷，即灭菌前原材料、部件、或包装等物品上所带有存活微生物的总数。

3

2. 生物指示剂（Biological Indicator）

接种已知数量微生物用于测试湿热灭菌工艺实际效果的产品。

3. 腔室冷点（Chamber Cold Spot）

指在灭菌过程中，装载区中F0或温度最低的位置。

4. 化学指示剂（Chemical Indicator）

化学指示剂是能展示一个或多个预定工艺变量的测试系统。化学指示剂不能证明产品是否无菌，它们只能说明产品是否灭过菌，所以在湿热灭菌的验证中，化学指示剂不能代替生物指示剂和温度/压力等的仪器测试。

5. D（Decimal Reduction）值

微生物耐受参数，系指在一定温度下，使微生物的数量减少一个数量级或90％所需要的时间。D值越大，说明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同的环境条件下（如不同的灭菌温度、不同的介质环境）可能具有各不相同的D值。在湿热灭菌中，DT系指微生物在灭菌温度T℃下的D值。一些文献中，如不是特指的其它灭菌温度，D的测试温度通常可理解为121℃。

6. 蒸汽的干燥值（Dryness value）

系含水蒸汽中蒸汽的测量值。干燥值为100%即是饱和蒸汽。蒸汽的干燥值与它具有的潜热直接有关，如干燥值为0.5时，表示蒸汽和水的比例为50:50，其潜热量只有饱和蒸汽的50％。

7. F值（F-value, Lethality Factor，或Process Lethality ）

指灭菌效力的度量值。F(T，Z)是在规定的Z值下，一个灭菌程序赋予一被灭菌物品在参照温度T下的等效灭菌时间，简称T℃灭菌时间。

实验数据表明，在湿热灭菌中，微生物死亡遵循一级动力学反应。灭菌程序的杀灭效果是灭菌温度T下，微生物耐热参数DT和灭菌时间FT的函数。微生物的存活曲线可以用下面的半对数式表示：

式中

NF：被灭菌物品在灭菌F分钟后，微生物的残存数量；

F（T,Z）：在温度T℃和该温度Z值条件下，灭菌程序经计算的杀灭力，以T℃下的时间（分钟）表示；

DT： 微生物在T℃和Z值下的耐热参数； N0：灭菌程序开始前，物品的初始菌数量。

Fphy系指以灭菌工艺的物理参数为基础的物理杀灭力，它与灭菌温度、Z值相关。在同一湿热灭菌程序中，灭菌率L是灭菌温度的函数。L（灭菌率）和Fphy（物理杀灭力）的计算式分别如下：

4

或

T℃升温保温冷却产品温度腔室温度L（杀灭率）t1

t2灭菌过程的温度-时间曲线

t（分）

图1 灭菌过程温度-时间曲线与F0关系图

上式中，t1表示灭菌过程中产品升温达到100℃的起始时间，t2是产品冷却至100℃（灭菌保温阶段结束）的时间，∆t是记录灭菌温度的间隔时间。（100℃以下对F0值影响极小，可以忽略）。

FBIO系指灭菌过程的生物杀灭力。它可通过指示剂挑战试验或微生物实际杀灭试验中求得。生物杀灭力的计算公式如下：

上式中，N0为初始菌数，NF是灭菌后的残存菌数，D为下降一对数单位所需的时间。

F0值（标准灭菌时间），是指Z取10℃时，一个湿热灭菌程序赋予被灭菌品121℃下灭菌的等效灭菌时间。例如，某产品在117℃灭菌20分钟或115℃灭菌32分钟的灭菌效果均相当于121℃下灭菌8分钟。

8. 阴性分数法（Fraction-Negative Methods）

指取生物指示剂的起始值（N0）及有序灭菌的数据来建立一条二点的直线，以此确定DT值的方法。此方法必须采用一组试样，经有序加热后，获得相反结果--一些样品为阳性，另一些样品为阴性，然后按阴性样品的比例数计算D值。

9. 热穿透（Heat Penetration）

热穿透试验是一个用以评估热量已经转移到被灭菌品的测温试验。为了测试热量的穿透，应将测温探头放置在需评估的装载上（或装载物品中间）。

10. 杀灭率（Lethal Rate）

指某一温度下灭菌1分钟与121下灭菌1分钟的比值，即某一温度下灭菌一分钟所相当

5

的标准灭菌时间，以L表示（参见术语6）。

11. 湿热（Moist Heat）

系指用于灭菌的蒸汽、蒸汽-空气混合物以及过热水。

12. 不冷凝气体（Noncondesable Gases）

指在灭菌条件下不会冷凝而释放潜热的空气及其它气体。

13. 运行参数（Operating Parameters）

共同界定灭菌程序每一阶段（如抽真空、升温、保温、冷却）且需加以控制和/或测试的数值（如压力、温度、时间）。

关键参数（Critical Parameters）：指与产品安全及有效性相关，需加以控制和/或测试的数值，关键参数失控应直接导致装载报废的结果。

重要参数（Key Parameters）：用以确保运行中灭菌过程处于“受控状态”而需进行控制和测试的数值。任何重要灭菌工艺参数不符合标准，应进行调查，并有说明装载处置合理性文件和记录。

14. 过度杀灭程序（Overkill Approach）

一个对产品生物负荷信息要求很低的灭菌程序，即用一个假设的最差的状况，来确定被灭菌品非无菌的概率小于10-6的程序--要求FPHY和FBIO均大于12分钟的程序。

15. 预真空程序（Prevacuum Process）

以真空手段排除灭菌腔室中空气后再进入灭菌阶段的灭菌程序。此程序特别适用于对包藏或夹带空气的物品，如织物、胶管、过滤器和灌装机部件等的灭菌。

16. 灭菌工艺性能确认（Process Performance Qualification）

也称为验证，系指有文件和记录证明一个灭菌系统在规定的运行环境条件下，能够始终如一地按预期要求完成并控制灭菌工艺的一系列活动。

17. 饱和蒸汽（Saturated Steam）

又称干蒸汽，系指与水蒸发曲线的温度与压力相应的蒸汽，即处在汽液平衡状态但不夹带液体水的蒸汽。

18. 蒸汽－空气混合气体（Steam- Air Mixture）灭菌

以饱和蒸汽-空气混合气体为加热介质的灭菌方式。空气的作用主要是平衡灭菌过程密封容器中的空气膨胀及药液汽化产生的内应力，尽可能减少冲盖、炸瓶、软包装容器形变等质量风险，提高最终产品密封的可靠性。

为了防止被灭菌装载中形成冷点，减少蒸汽损耗，灭菌过程必须保持蒸汽和空气混合物气体的不断循环。

19. 灭菌（Sterilization）

用以去除产品中活的微生物并使其达到规定存活概率的处理过程。

20. 无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）

6

产品/物品经灭菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越低。为了保证注射剂的无菌安全性，采用湿热灭菌法的产品，其SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一；而采用无菌制造工艺生产的产品，如冻干或无菌分装

-3

的产品，其SAL一般只能达到10的水平。

21. 灭菌程序（Sterilization Cycle）

一个使某一物品达到无菌所需条件及规定运行参数（如时间、温度和压力）的程序。

22. 过热水程序（Superheated Water Process）

也称过热水喷淋灭菌程序，是在空气加压条件下，通过循环泵强制过热水循环，持续与被灭菌产品进行热交换的灭菌方式。此程序中，加压的作用不但是保持循环水不发生汽化，而且要维持被灭菌产品包装容器内外压力的平衡，以防止冲盖或包装变形等产品缺陷。

23. 验证（Validation）

一个能够科学地确保生产工艺生产出合格产品的有文件和记录证明的程序。验证的证据应通过验证方案的合理设计及对验证结果的科学、全面的分析和评估获得，这一过程最好始于工艺的开发阶段，持续地进行，直至商业化生产。

24. 灭菌温度系数（Temperature Coefficient, Z value）

使D值变化一个对数单位温度需调整的度数（℃）。

四、湿热灭菌基础

4.1湿热灭菌的机理

湿热灭菌是研究最深、使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动的温度范围时，随着温度的升高，细胞代谢减缓，细胞的生长及繁殖最终停止。每种细胞对温度的耐受性均有一上限，一旦温度超过它的上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性破坏，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。简言之，从机理上说，在湿热灭菌中，芽孢的死亡属蛋白质的变性，所需灭菌温度较低。与此不同的，干热灭菌从机理上说则属于氧化，因此，所需灭菌温度要比湿热灭菌要高得多。

4.2影响芽孢耐热性的因素

细菌芽孢的耐热性与很多因素相关，这些因素尚未完全弄清。芽孢形成时，细菌停止生化反应，并将遗传物质包藏在芽孢中。此期间发生了一系列生理变化：细胞质大量脱水，体积变小，并在缩小的原生质体周围形成一层厚壳。此外，还会形成一种名为吡啶二羧酸或DPA（吡啶-2,6-二羧酸）的特殊化学物质。芽孢形成阶段，吡啶二羧酸钙与DNA(脱氧核糖核酸)以及细胞内的酶形成复合物，它们能保护处于休眠状态的芽孢。芽孢可以在休眠状态下存活多年，有的可存活上百万年，一旦出现有利于芽孢适于繁殖的条件，它便可在几分钟内恢复到生长状态。在湿热灭菌中，了解影响微生物耐热性的因素对设计灭菌程序、验证及日常监控十分重要，现对主要的影响因素简要说明如下：

7

4.2.1物理/化学条件

在细菌芽孢形成期，环境因素影响芽孢的耐热性。例如，温度较高并有二价阳离子（如 Ca2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+）存在时，芽孢的耐热性增强；在另一些条件下，如当pH值超出6.0-8.0的范围时，或在高浓度的盐水或磷酸盐中形成芽孢时，芽孢耐热性下降。

、pH自然界中芽孢的耐热性还与环境条件相关，如溶液浓度、水份（相对平衡湿度aω）

值、对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等，它们均会影响芽孢的耐热性。

包藏在晶体或有机物内的芽孢，其耐热性通常明显高于一般非包藏态芽孢。因此，在某一温度条件下，将泥土包藏性芽孢和从泥土培养得到的芽孢同时灭菌时，要想获得相同的灭菌效果，前者所需的灭菌时间是后者的十倍。理解这一点，有它的现实意义，因为待灭菌品要是受到了泥土中芽孢的污染（如在运输处理中被未经过滤空气的微粒所致的污染，或者由人员或其它物品接触所致的污染），则很难被完全杀灭。换言之，药品生产企业的HVAC系统设计和维护，物料、容器、工器具等的清洗及处理，对灭菌的安全性起有十分重要的作用，湿热灭菌的安全性不能只局限于产品的最终灭菌。 4.2.2湿度

在热力灭菌中，水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种：湿热和干热。湿度达到饱和条件下[相对湿度(RH，relative humidity)为100％（或aw=1.0）]的灭菌方式称为湿热灭菌；相对湿度低于100％条件下的灭菌方式统称干热灭菌。有证据表明，温度在90～125℃之间，相对湿度在20～50％时，细菌芽孢的耐热性强,较难杀灭；当相对湿度高于50％或低于20％时，芽孢的耐热性迅速下降，比较容易杀灭。

人们普遍认为湿热灭菌之所以有效，是在于热使细胞内的起生命作用的蛋白质和酶发生变性或凝固。水分对灭菌有促进作用，湿热灭菌所需的温度低于干热灭菌所需的温度，是这一论点的依据。

4.3湿热灭菌中的能量转移

温度是热能的度量。热量是物体及其周围环境之间因温差而发生能量转移的结果。 对于适宜采用湿热灭菌方式的产品或物品而言，湿热灭菌不失为一种十分经济而又有效的方法。饱和蒸汽灭菌是湿热灭菌中最常见的方式。饱和蒸汽灭菌、过热水灭菌（喷淋、直接浸泡/过热水旋转灭菌等，发生着多种形式的能量转移，包括传导、对流和辐射。在湿热灭菌中能量（热能）通过容器壁，传给被灭菌药液，或通过灭菌介质（蒸汽或过热水）直接接触传给被灭菌品，这种形式属热传导。

饱和蒸汽和过热水特性参见第十章附表3.

饱和蒸汽灭菌中，能量的转移主要依靠蒸汽的相变。当水由液态变成汽态时，需要吸收大量的热能（汽化热：540卡/克）。在灭菌过程中，当蒸汽接触到温度较低的物体时，就会释放540卡/克的潜热，生成冷凝水，直到物体的温度与蒸汽温度相等。这个高效的热传递方式，是其他任何方法无法相比的。在预真空灭菌程序中，无论是高真空或脉动真空灭菌，虽然在灭菌的初期尽可能的排除了腔室及被灭菌物品（如过滤器、衣服、口罩、灌装机部件、软管等）的空气。但这并不意味着已排除了妨碍灭菌的全部障碍，冷凝水及时而通畅的排放，

8

和排除空气同样重要，冷凝水如不及时排放，将大大影响蒸汽灭菌的效果。

过热水灭菌过程中，能量的转移主要靠过热水的质量（mass），携带热量的大量过热水与被灭菌产品直接接触，通过容器壁，将热能传递给容器中的内容物并杀灭其中的微生物。因此，为了使灭菌的获得良好的均匀性，喷淋循环是十分必要的。有数据表明，在过热水喷淋灭菌过程中，装载对灭菌程序的影响较小，如果不是旋转式菌器保持旋转平衡的需要，则不需要采用替代品将灭菌器装满后按满载灭菌程序来处理。

在SAM的灭菌应注意的要点，将在8.1.1中加以讨论。

要提高灭菌的效果，就必须特别关注灭菌设备的安装、灭菌程序设计，这也是湿热灭菌验证成功的必经之路。

4.4湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式

本节拟对灭菌程序的设计、开发、确认和验证所采用的基本科学手段作一概述。

实验表明，在恒定的灭菌条件下，微生物（只指芽孢）的死亡遵循一级动力学规则。芽孢的杀灭率（体现为残存曲线）是耐热性的函数，与芽孢的数量无关。采用内生芽孢（生物指示剂BI）的悬浮液或放在载体形式的芽孢进行灭菌试验的结果表明，在湿热灭菌中，半对数规则适用于芽孢的灭活过程。因此，残存曲线可用如下的一级方程式来描述：

Log NF = Log No -F(T,z)/DT

式中，

NFNo DTF(T,z)

挑战微生物灭菌F分钟后的残存数 灭菌前微生物的数量

微生物在T℃和Z值下的耐热参数。注意，DT中的温度T需和FT中的温度相一致。

在温度T℃和温度系数Z值条件下，经计算获得的湿热灭菌程序的杀灭力，以T℃下的时间（分钟）表示

微生物杀灭的数学模式的其它计算公式，参见术语第6条。

在恒定灭菌温度下，理想灭菌速率（微生物残存曲线）可用下图表述：

9

N1061051041D2D3D4D5D6DD=11D2D3D4D5D123456710116D12%0909999.999.9999.99999.9999

每一单元的残存数10310210110010-110-2杀灭的 %

残存概率区10-310-410-510-6T度下的等效灭菌时间（F 值）T,z

图2 理想微生物残存曲线

上图中，DTz为1分钟，如T为121℃，Z取10℃时，本图体现了美国药典在《无菌保证》

作为被灭菌品的最差状况来处理。如在121℃的灭菌时间≥12中过度杀灭的要求。N0为106，

分钟，则微生物残存的概率将小于10-6。

DT是半对数残存曲线的斜率的量度值，因此，它阐述了残存微生物与灭菌时间的关系。某一微生物的耐热性，实际上与对其测试时的生理状态及环境（如pH）相关。

在半对数湿热灭菌模式中，Z类似于温度系数，它描述灭菌温度变化对生物指示剂耐热性的影响，这也是灭菌过程的升温和降温阶段中，计算标准灭菌时间必不可少的参数。Z较大，说明通过提高温度的方式来提高灭菌的有效性收效较小，反之，如Z较小，则提高灭菌温度对杀灭率的影响就比较明显。

F是半对数模式中用以阐述灭菌时间的术语。根据定义，F值是按某个参照温度来定的，因此，它是以等效灭菌时间的形式来表述湿热灭菌的杀灭力。由于常规灭菌通常不可能是方形波，即被灭菌品不可能在瞬间达到所需的灭菌温度，冷却过程也不可能瞬间降到常温，此时，需要用温度系数z值来计算不同温度下的等效杀灭率，然后再对时间积分求得F值。由于Z的引入，对F0的计算至关重要，因此，本文附录中收载了Z的推导文献。

应当指出，一级反应只不过是用以表述单细胞芽孢死亡动力学经验公式。它未必适用于所有的生物指示剂系统，可采用其它的模式来描述微生物死亡的动力学。不过，过于复杂的公式，难以在生产中采用，这里不再赘述。

残存曲线的半对数模式必须满足二个先决条件： 1) 挑战菌应是均一的（没有其它杂类芽孢）

2) 挑战菌的灭菌条件相同，或能折算成相同的灭菌条件，例如，折算标准灭菌时间

半对数模式并不准确地适用于所有的试验微生物，然而，据我们所知，迄今还没有找到一个数学模式，能够适用于所有试验微生物。在工业上能采用的数学模式必须具备以下条件：

1) 数学模式具有科学性；

2) 有良好的安全性，即按该模式处理，可保证被灭菌药品的安全性； 3) 容易理解，便于应用。

10

半对数模式及其图形，既可直接用于分析试验数据，也可用于设计微生物控制程序。这也是此模式在学术界和工业界获得普遍认可和广泛采用的理由。

五、灭菌法选择的基本原则

众所周知，药典收载的灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、除菌过滤等，液体产品以最终灭菌方式采用湿热灭菌则是首选的方法。

美国《药品生产验证指南中》中提到了一个十分重要的观点，这就是说，去验证一个不合理的系统是没有意义的。本指南认为，验证的试验是有限的，不应当将有限试验数据拼凑成所谓的“验证报告”，为一个设计不合理的系统或方法辩护，从而给产品和患者带来风险。这一风险管理的理念，在欧盟的灭菌方法决策树及注释中得到了充分的体现。

在灭菌方式的选择上，欧盟在药品研发指南注释附录（CPMP/QWP/155/96）阐述的基本原则值得借鉴（参见图3）。

考虑到产品的热稳定性和受热降解等实际情况，尽管本指南不期望会有很多产品能够采用121℃ 15分钟的灭菌程序，但它的基本原则对液体产品灭菌方式的选择有着重要的指导意义。

液体产品灭菌选择决策树

产品是否可以121℃湿热灭菌15分钟

否

产品是否可以湿热灭菌F0≥8分钟,达到SAL≤10-6否

该处方是否可以用除菌过滤法过滤否

将各组分先分别灭菌再无菌配制﹑灌装　

是

使用除菌和无菌制造工艺相接合的办法

是 使用湿热灭菌 F0≥8分钟

是 使用高压灭菌器121℃×15分钟的程序

图3 欧盟液体产品灭菌决策树

本指南认为，除特殊情况外，对液体产品而言，首选的灭菌程序是121℃ 12分钟的程序（过度杀灭程序），当产品的处方热稳定无法采用这一程序时，则可采用F0≥8分钟的程序。应当指出，过度杀灭法以杀灭微生物作为实现产品无菌的手段，对整个工艺的控制要求较低；而F0≥8的残存概率法的工艺，将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是依赖最终灭菌去消除微生物污染，因此，整个生产流程的工艺控制要求比较严格。

在产品不能采用以上二种程序而不得不采用其它手段时，可参照以上决策树的程序，往下采用最终灭菌方式的替代方法，此时，应采用一切手段最大限度地减少产品灭菌前的生物负荷，按我国现行条件来说，即是采用无菌制造工艺，即便如此，应当理解，产品的无菌保证水平将大为降低。欧盟无菌药品附录第82款提到：就最终可灭菌的产品而言，仅采用除

11

菌过滤是不充分的。现行的灭菌法中，蒸汽灭菌应是首选的灭菌法。如果药品不能最终灭菌，可用一孔径为0.22μm或更小的除菌过滤器… 将药液过滤…，但不能将病毒或支原体全部滤除。应考虑采用某种程度的热力灭菌来弥补除菌过滤的不足。因此，一些实行流通蒸汽灭菌法的小容量注射剂，应参考无菌制造工艺的控制条件，并以流通蒸汽灭菌来弥补除菌过滤的不足，提高无菌保证的水平。

本指南认为，包装材料热稳定差不得成为采用无菌制造工艺的唯一理由。生产企业应当将选择适用于某个特定处方的最佳灭菌方法放在首位，然后再考虑选择相应的包装材料。举例来说，某类产品，只要有适当的充氮保护措施，产品完全可在121℃灭菌，达到F0大于12的结果，那么，就没有理由因软袋包装不耐热，而以除菌过滤和流通蒸汽灭菌法取而代之。

当然，也有因容器类型、给药途径和病人对产品的可接受性而选择某一特定类型的容器（如某些眼科用药），而该容器无法经受最终热力灭菌工艺，这种情况通常是可以接受的。在这些情况下，生产企业有责任继续寻找可接受的替代容器，以便在条件成熟时，采用首选的最终灭菌法。

由于最终灭菌具有最高的无菌保证水平，因此，不得因商业原因而将本来可以采用最终灭菌F0≥8的工艺，以牺牲产品的无菌保证水平为代价，改成无菌制造工艺。

六、灭菌方法的开发及选定

6.1湿热灭菌方法选择决策树

在明确了产品灭菌法选择的基本原则之后，即转入另一个课题--灭菌方式的选择。显然，不同特性的产品、材料的灭菌，需要采用不同的灭菌设备和灭菌方法。美国注射剂协会采用下图来协助药品研发、制造人员选择适当的灭菌方法。

12

否是热稳定产品吗?是采用特殊方法采用过度杀灭法多孔/坚硬物品被灭菌品的形式?密封液体产品需考虑抽真空?需加压吗?要不要现有抽真空灭菌器?可用过热水程序?要有无可不可SAM程序任何湿热程序脉动真空程序重力置换程序过热水或SAM

图4 湿热灭菌方法选择决策树

在国际上，湿热灭菌工艺开发和应用，可采用两种方法：过度杀灭法（the overkill method）和残存概率法（Bioburden based process），也称生物负荷法。美国注射剂协会提到product-specific，按其中文意思来理解，即是“因品种制宜”的方法。从实际内容看，与残存概率法原则基本相同，即经最终灭菌后，微生物残存的概率小于10-6标准没有变，但对F0的要求有一定的灵活性，美国注射剂协会认为，严格实施cGMP、高的自动化程度以及低污染的软包装材料的采用，使一些产品的生物负荷很低，例如，每个容器中生物负荷在1至100个菌之间，且多数是不耐热菌。一般说来，当生产环境中出现了芽孢或从产品中分离出芽孢时，才需要测试D值。将产品在80-100℃下，加热10-15分钟，先将耐热性差的微生物筛选掉，再根据耐热性强的微生物的DT来确定安全限度，这样一来，F0可能不一定需要满足≥8的要求。热稳定性差的产品，达不到F0≥8时，须按无菌制造工艺要求严格控制环境及工艺的各个环节。可以理解，只要产品的热稳定性允许，“因品种制宜”的方法理所当然地会选用F0≥8的灭菌程序。

简言之，F0只是个手段，低于百万分之一的残存概率才是湿热灭菌产品的“无菌”标准。中国业内人士一直注视着国际制药技术的进展，美国注射剂协会的上述观点，早在2005版中国药典《灭菌法》中已有体现。然而，众所周知，人是主要的污染源，我国绝大多数企业目前的自动化程度、生产全过程的监控和管理还不可能达到美国注射剂企业的水平，执行F0低于8的标准，就必然需要强化整个过程的微生物污染控制，在采用无菌制造工艺的前提下，再作适当的热力灭菌处理，即使这样，其无菌安全水平也会比F0≥8残存概率法低。

13

6.2过度杀灭法

只要条件允许，产品的湿热灭菌就应采用过度杀灭法（the overkill method），这是因为它对工艺全过程的控制要求相对较低，而安全性却十分高。采用过度杀灭法的目标是确保达到规定的无菌保证值≤10-6，而不必担心装载的生物负荷和耐热性，本指南图1系最差状况的示意，事实上，在企业实际生产中，只要遵循GMP的要求，不可能出现那种一个包装单元中（如瓶、袋）芽孢数达到一百万个的糟糕情况。

假定生物负荷的数量和耐热值设为如下水平：

N0＝106

D121＝1分钟 Z＝10℃

将数据代入公式

，得L=1，再按

计算，达到微生物残存概率为

一百万分之一所需的物理及生物杀灭力如下：

物理杀灭力FPHY为12分钟，

生物杀灭力 FBIO ＝D121×（LogN0－Log NF）＝12分钟

自然界中很少检到D121℃大于0.5的微生物，这已被国内一些合资企业20多年的实践所证实。在过度杀灭法程序设计中，设定的芽孢数量应高于日常实际监测到的数据，其耐热性也应比日常监控中分离菌的耐热性高，这样设定的灭菌程序才具有挑战性，以致在产品检出耐热菌株时，便于对灭菌后微生物残存的概率科学地加以评估。

湿热灭菌工艺采用为过度杀灭法后，对被灭菌产品的初始菌监测要求就比较低，不需要每批进行测试，除非是实施参数放行的产品。

需要说明的是，与美国药典过度杀灭程序有所不同，欧盟法规将湿热灭菌过度杀灭程序定为121℃ 15分钟，这既是最终灭菌药品努力的方向，也反映了欧盟制药业的现实。其实，在美国及我国，均有这类能经受121℃ 15分钟的产品。事实上，有一些处方相同的产品，例如复方氨基酸和脂肪乳剂，只要在生产工艺条件方向上加以改进，121℃ 15分钟的程序并不是无法实现的。如果处方、工艺条件或包装材料难以经受121℃ 15分钟程序时，那么，仍可按决策树的方向，选择其它适当的灭菌程序。

6.3残存概率法

耐热性较差的产品或物品灭菌就不能使用过度杀灭法。因此，需要建立一个灭菌程序，它必须能杀灭产品中的污染菌，同时又不会导致产品降解物/副产物在整个生命周期内超标，这就是残存概率法。这与PDA技术报告N01中按产品特性进行设计的方法（Product specific approach）相呼应。残存概率程序的灭菌温度通常低于121℃，如117℃或118℃等。设计残存概率程序，需要选定初始菌的控制限度N0、再设定灭菌温度下的DT，此外，灭菌还需要留有安全的余量。后者需要经验、日常监测获得的生物负荷数据的波动范围等，这可以参照

14

同类产品的数据来定。有些企业很可能以前从来没有测试过生物负荷，那么现在可做一个阶段的测试，以使设定的参数查有实据，虽说这是后补，但它总是一个完善的过程，应当加以肯定。获得上述数据后，就可以正式设计出一个能达到SAL小于10-6的灭菌程序。

按GMP规范要求生产时，可以预期，玻瓶产品的生物负荷会比较高，而软包装产品实际生物负荷数则比较低，后者约在1～100CFU/包装的水平，将灭菌前产品在80～100℃下加热10～15分钟，可以杀灭生长态的菌及耐热值低的微生物，获得每个包装单元中耐热的菌的数量，计算灭菌后微生物残存的概率，例如，

假设产品的生物负荷测试中： N0＝102

D121＝1分钟 Z＝10℃

要求经灭菌后，微生物残存概率NF小于10-6

利用上面的数值，可以计算出微生物残存概率小于10-6所需的FPHY和FBIO如下：

F0＝FPHY＝FBIO＝D121×（LogN0－Log NF）＝8分钟

对有效过滤面积较小的除菌过滤器而言，缺陷假单胞菌（Brevundimonas diminuta）挑战试验确立了除菌过滤器的起泡点与除菌过滤的性能的相关性，与此相似，生物指示剂的挑战性试验确立了标准灭菌时间与杀灭微生物性能的相关性。因此，标准灭菌时间F0直观地反映了湿热灭菌程序的杀灭能力。将Lethality Factor，或Process Lethality作为灭菌效力的度量值。虽然它以分钟为单位，但它的内涵体现了湿热灭菌的杀灭微生物的能力。

可以理解，源于植物为原料药的注射剂，其生物负荷比一般化学药品高，存在耐热芽孢的概率也会比较大。在设计灭菌程序时，更应当特别注意收集生物负荷的数据，从日常微生物监控中建立生物负荷的数据库，不仅仅是微生物的染污水平，还应包括污染菌的耐热性。

以残存概率法（生物负荷法）为依据的灭菌工艺，通常要求对每批产品灭菌前头、中、尾的产品进行生物负荷（带菌量/污染水平）及耐热性的测试，积累微生物污染的数据资料。如果多年以来证明在实际的GMP控制条件下，污染水平很低，且检不到耐热菌，那么，监控的方案可酌情作适当的调整。

6.4 装载类型的界定

选择适当的灭菌程序，还需要充分考虑到装载特性对灭菌效果的影响。

在制药行业中，多孔/固体装载包括过滤器、织物，不锈钢容器、灌装机部件等。不管这类装载的具体细节如何，一般不再细分，只采用通用的灭菌程序。这类物品通常用饱和蒸汽灭菌，让蒸汽与被灭菌品直接接触，能量通过传导和/或对流传给被灭菌品，同时，蒸汽冷凝，生成冷凝水。这类物品通常采用过度杀灭程序，如织物、不锈钢类物品的灭菌，F0通常超过30分钟。

一个确定的湿热灭菌程序应当考虑到装载的特性及特定装载的方式。例如，多孔/固体物品通常包括但不局限于以下物品：

y 过滤器（薄膜式过滤器、筒式过滤器、预过滤器等）

15

y y y y y 胶塞和其它聚合物密封件 管道和软管 工作服、口罩 清洁用具

设备更换部件，如药液灌装头

液体装载通常包括但不局限于以下物品：

y 已灌装入最终容器（如小瓶、软包装、玻瓶或安瓿）的产品（溶液、混悬剂或乳剂） y 已检验或加工后剩下的可能含有致病菌的废液。

出于保护密封完好性及提高产品收率的目的，液体产品的灭菌通常需要采用空气加压的灭菌程序。

6.5湿热灭菌对介质的要求

用于湿热灭菌介质包括蒸汽、压缩空气、冷却水，还有用于安瓿的“检漏色水”等。为了避免产品灭菌后的二次污染，与产品接触的介质应是无菌的。

6.5.1蒸汽

在一定温度下，不同加热介质（灭菌介质）的热能有很大差别。过热水、饱和蒸汽和蒸汽-空气混合物含有不同的热能。只有饱和蒸汽作为灭菌介质时，蒸汽的温度和压力之间存在对应关系（见附表1）。

湿热灭菌采用的蒸汽包括工业蒸汽和纯蒸汽，二者使用的场合不同。工业蒸汽一般不应与药液过滤器、灌装机部件类被灭菌品直接接触，只用于转移能量的目的。它可用于脉动真空灭菌器的夹套（外层）加热。在过热水灭菌过程中，则可用作热交换器加热灭菌用水（通常是纯化水）的热源。一种较常见的情况是工业蒸汽用于小容量注射剂（安瓿）的最终灭菌，然而，应当认识到，少数安瓿可能存在密封性缺陷，微量的工业蒸汽有可能进入这类有缺陷的安瓿，且在检漏和灯检中难以发现，这会给患者带来风险。据不完全统计，在湿热灭菌过程中，国内约有40%的企业采用工业蒸汽来灭菌与产品直接接触的过滤器、不锈钢容器及灌装机部件，这种状况应引起重视，并尽快采取相应措施。

由于灌装部件、过滤器等直接与产品接触，灭菌腔室中的蒸汽应采用纯蒸汽。纯蒸汽，也叫做洁净蒸汽和高质量蒸汽。纯蒸汽的冷凝液应符合中国药典注射用水的要求。纯蒸汽可以由纯蒸汽发生器生产，也可由蒸馏水机提供。获得纯蒸汽的方式，可由企业根据产能平衡的要求自行决定。

除化学项目（纯蒸汽冷凝水）外，参照GB 18278－2000《医疗保健产品灭菌 确认和常规控制要求 工业湿热灭菌》附录，本指南建议蒸汽的其它技术指标如下：

蒸汽的干燥值（Dryness value）不低于0.95；

不冷凝气体（non-condensable gases）不大于3.5%(V/V)； 蒸汽压力波动不超过10％；且其降低比例不大于2:1。

为了提高灭菌介质的安全性，企业可根据国家标准，制订企业的内控标准。

蒸汽质量的测试一般包括3项，过热值、蒸汽干燥值、不凝性气体，测试方法见本指南附录。

16

6.5.2压缩空气

直接接触产品的SAM压缩空气、压力平衡用压缩空气等尽可能采用无油压缩空气或经处理后含油量符合GB/T 13277-1991《一般用压缩空气质量等级标准》附录A“推荐使用的压缩空气质量等级”中“食品饮料加工”相关要求：含油量≤0.01mg/m3。

此外，脉动真空灭菌器在干燥结束后、冷冻干燥机冷干作业结束后向柜内补入的空气应加装0.22μ疏水性除菌过滤器。

6.5.3冷却水

在喷淋或旋转喷淋式灭菌器中，通常采用符合药典要求的纯化水。在灭菌过程中，纯化水随着产品一起被加热灭菌，因此，通常不必担心它会带来污染。

为了防止热交换器的冷却水因为渗漏，在灭菌的冷却阶段进入腔室，带来二次污染的风险，这类灭菌器应采用双板管式热交换器。

以SAM形式对液体产品灭菌方式中，如采用风冷形式，只有热交换器能保证冷却介质不进入腔室时，才能采用自来水或冷冻水作为冷却介质。如采用水喷淋形式，则应控制冷却水的微生物，杜绝二次污染的风险。

为了防止产品的二次污染，安瓿检漏用的色水，也应按无菌要求考虑，因为检漏过程中有加压或/及抽真空的过程，这与灭菌冷却阶段的二次污染相似。

七、湿热灭菌器的程序控制和记录仪表

对于湿热灭菌而言，程序控制及灭菌过程的记录仪表实在是太重要了。因此，需要确立单独的技术性标准及相关管理标准，规定它的运行范围、精度要求、可追溯性及温度补偿的授权范围（不得由操作人员直接随意更改）及记录要求等。

7.1 WHO GMP的原则要求

WHO GMP 2006在“热力灭菌”中指出： 6.1 对于每次加热灭菌过程，应使用适当精密度和准确度的设备对关键运行参数进行记录，例如使用规格适当的记录仪记录灭菌过程的时间/温度趋势等。尤其重要的是，应在被灭菌品或灭菌腔室冷点处安装温度探头，通过记录仪记录该点的温度情况，该冷点通过验证确定。为提高此温度参数的可靠性，应在同一部位安放另一支的测温探头，用显示仪表显示温度数值，供操作人员直接与记录仪记录的趋势图进行对照。灭菌图谱或其复印件应收录入批记录中。可使用化学或生物指示剂，但它们不得替代物理测定。

6.2 开始测定灭菌时间前，应有足够的时间，保证所有被灭菌品都升高到所规定的灭菌温度。必须确定每种装载方式所需的升温时间。

6.3 在灭菌高温阶段后，应采取措施防止冷却期间已灭菌品遭受污染。任何与产品相接触的冷却用液体或气体都应经过灭菌或除菌处理。

此外，WHO GMP在“湿热灭菌”中还提到：

6.4 湿热灭菌法（在灭菌器中加热）仅适用于水浸润性材料或水性药液。过程监控参数应包括灭菌温度、时间和压力等。一般情况下，程序控制系统应于温度记录仪表，并应配有的温度显示器，可以将温度显示器的读数与灭菌全过程中的记录表进行对照。对腔室底部装有排水口的灭菌器而言，有必要测定并记录该点在灭菌全过程中的温度数据。如灭菌过程中含有抽真空步骤，则应定期对腔室进行检漏试验。

17

7.2 技术性要求

欧洲标准 EN285《大型蒸汽灭菌器》对蒸汽灭菌器的温度显示有详细的规定，例如：腔室温度显示仪应是数字或模拟显示，显示单位为摄氏度，显示范围应涵盖50℃~150℃，且在此区间内精度应优于或等于1%。对于模拟显示仪，其最小刻度应不大于2℃；对于数字显示仪，其显示分辨率应≤0.1℃。当灭菌时间小于5分钟时，时间显示的精度应在±2.5%以内；当灭菌时间≥5分钟时，时间显示的精度应控制在1％以内等。温度和压力监测设备安装接口，要求符合医药卫生规范，不锈钢卫生接口。过程参数记录设备内置于灭菌腔室的部件应符合在现场方便清洗、消毒的要求，控制电器绝缘性能达到IP67以上的防护等级。

本指南认为，为了保证灭菌器运行准确、可靠，应配置控制系统与记录系统：一为灭菌器的程序控制系统，此系统能显示，可有纸质记录、或将记录数据贮存于电脑硬盘及其它储存设备中；另一个为记录系统，通常为纸张形式输出的模拟曲线，曲线上包括温度、压力和时间的显示。

温度探头还有一个容易忽视的方面--它的导线部分，导线外面的硅胶管是耐温、耐压和耐湿的。在使用过程中，当导线软管部分逐步老化时，其性能下降，水蒸气就可能会进入软管内部，因此会导致电阻值漂移，干扰测量、控制系统的稳定性与准确性。选购时应十分注意温度探头的质量，避免因小失大。

现部份国产湿热灭菌器所用的探头、温度、压力变送器质量较差，不稳定，波动较大。 本指南认为，灭菌器生产厂商和使用单位应选用质量较好的测温系统（包括控制、记录）。测温系统（通过变送器调节或在程序中进行补偿）的校准是可以由制药企业自己进行的，这当然需有相关的技术人员，需有更高等级并能溯源至国家标准的参照仪及温场（如恒温浴、干井等）。如没有这样的资源，可委托县级以上计量行政部门指定的技术机构或具有相关资质的校准实验室进行检定或校准。此外，如校准时发现灭菌器测温系统的测量误差超出最大允许误差范围，应对该灭菌器之前灭菌的产品及运行数据进行追溯，以保证其不会危及产品的无菌要求。

7.3对验证用测试仪器的要求

7.3.1 校准参照标准精度要求

验证用仪器精度应高于被验证灭菌设备精度3至5倍，即如设备精度要求为允差小于等于±1.0℃，则仪器允差应小于等于±0.33℃或±0.2℃。 7.3.2校准周期

校准周期要看采用什么样的温度测量系统来定。测量系统需要进行校准，校准（检定）周期企业应根据实际使用情况来决定，可三个月、六个月，最长不超过一年。

对验证仪和测温探头以有线方式连接的系统而言，由于接线盒的接线通道或接线方式经常改变，会改变测量通道的线阻，需在验证前对测温系统进行校准、验证后进行复核，以保证验证所得结果的准确性；如验证系统如是无线的，因没有需经常接、插的部位，可依据验证仪生产厂家的建议及企业实际使用频率、精度要求等确定校准周期。企业应确保灭菌器的温度压力测量系统、验证仪、参照仪的测量值能正确溯源至国家标准。

18

八、几种常用的湿热灭菌法

蒸汽灭菌器的安装，要求排水口与地漏间应有空气阻断（不得直接相连），以防止虹吸。此外，应有防止混淆的措施。以下介绍几种常见的灭菌法。

8.1液体注射剂产品的灭菌

在某批产品的湿热灭菌过程中，被灭菌的液体产品（注射剂）通常是同类型的，尺寸相同，容量相同，并来自于同一批产品。经验证后，同一湿热灭菌程序可能适用于其它类似的产品。应根据产品的技术要求设计好灭菌程序并验证其对产品的适用性。

8.1.1 SAM灭菌法

能量由加热介质传递给包装中的溶液，实现注射剂的灭菌。用空气加压的目的是平衡腔室与容器内的压力，减少瓶子的破损，提高收率。一般玻瓶产品的加压在药液升温到70℃后，一直保持到降温至70℃为止。对蒸汽-空气混合气体的灭菌程序而言，须用强制循环设备使蒸汽-空气混合物在腔室内保持循环，否则会出现被灭菌品温差大，部分产品过热，甚至出现降解；另一部分产品却达不到设定F0值的情况。另外，对于混悬剂和乳剂的灭菌，装载可能需要一定的运动状态（如旋转，或一定角度的摆动）来促进药液内部的热循环，保证灭菌过程中药液温度的均匀性。

蒸汽-空气混合物程序的冷却，有多种方式，最常见的方法是在腔室二侧安装热交换器，以冷空气循环的方式冷却，这种方式较费时；另一种方式是采用“无菌水”喷淋法，即对喷淋水有严格的微生物控制要求，例如，10CFU/100ml。为了保证灭菌器的密封性能，通常采用磁力电机驱动循环风机。

风机隔板热交换器灭菌装载热交换器

图五 蒸汽及空气混合气体灭菌器示意图

SAM灭菌有二点须特别注意，一是空气的加压要适当，否则有可能出现胶塞吸入瓶内或跳塞现象，出现这种情况时，意味着加压不当，这可能会使产品的密封性受损；其次，在

19

升温和冷却阶段，应适当控制腔室与被灭菌品之间的温差，例如控制在60℃以下，如温差过大，可能造成玻瓶产品瓶口裂纹的增加，软包装产品则密封性受损。

8.1.2 过热水喷淋法

过热水喷淋法目前应用十分广泛，图示是旋转式喷淋灭菌器，其运行程序大体如下： 进纯化水→液位控制→启动循环泵→工业蒸汽进热交换器加热→空气加压→保温灭菌→关闭工业蒸汽→开冷却水→到设定温度→排空气→卸载。如是乳剂产品，则灭菌程序启动时就需旋转。

工业蒸汽

冷却水循环泵

几乎所有的溶剂型产品，如一些玻璃瓶、软袋和半刚性容器，都存有一定量的气体（空气、氮气或其他气体）。液体被加热时，这类气体膨胀，溶液的蒸汽压也随着灭菌温度的升高而增大，因此，需要增大灭菌器腔室的压力，以平衡容器内外的压差，维持容器的形状和密封的完好性。不同类型及规格的产品类型（如玻璃瓶和塑料袋）所需的压力可能不同，需根据产品的具体情况进行调整，并正式列入产品的灭菌程序。空气加压过程中常用无油压缩空气，且需除菌过滤，以防止二次污染。

另一个需要注意的问题是采用热交换器的类型，如在这类灭菌器安装化工或食品级的板式换热器，会存在渗漏的风险，如上图所示，在灭菌冷却阶段，无微生物控制要求的冷却水，因渗漏进入已灭菌产品的腔室，参与循环，给某些密封存在缺陷的产品带来了二次污染的风险。这种状况是与7.1 WHO GMP 无菌药品的要求不相符合的，应予特别注意。

过热水喷淋法与其他的蒸汽灭菌法相比，最大的优点之一是加热和冷却的速率容易控制，温度分布均匀。

对于溶剂型产品的灭菌，需要确定以下操作参数（但不仅限于此）：

灭菌阶段

控制参数

对参数的说明

在过热水灭菌程序中，外壳温度/压力的控

制不是决定性的因素。如果需要控制，则外壳的温度不应高于灭菌器腔室的温度

20

整个灭菌程序 外壳温度/压力

蒸汽-空气混合物程序（SAM）中风扇的转速旋转速率

过热水循环流动速率

风扇应有故障报警装置 应有速度范围及故障报警装置 泵应包含低限启动故障报警装置

必须，记录仪带有合适尺寸的记录纸以便记录灭菌程序全部的温度/压力变化值，无纸记录仪能记录灭菌程序全部的温度/压力变化值，并具备异常报警功能。参数的记录能通过记录仪显示。存贮信息可通过计算机打印。

监控探头/记录探头

腔室的水位（过热水法）应包含最小水位的报警装置

对于饱和蒸汽的灭菌方法，可以根据温度

和压力的变化设置报警点；

加热时间

加热阶段

对于SAM，可以监控蒸汽-空气的比例； 对于过热水法，可以监控加热时间的波动

腔室加热速率（℃/分）SAM和过热水法均为关键参数 压力增加速率 SAM和过热水法均为关键参数 灭菌时间 灭菌阶段的温度 腔室温度波动

灭菌阶段

腔室压力波动 间接加热介质的温度 F0值

是所有灭菌程序的重要控制参数 是所有灭菌程序的重要控制参数 是所有灭菌程序的重要控制参数 是所有灭菌程序的重要控制参数 是所有灭菌程序的重要控制参数

对于灭菌器内置的测温探头，其F0值可用于对灭菌程序的评价

对于不小于3个灭菌器自带的测量探头，最大F0值的记录有利于灭菌程序的评价

F0值（最大值）

冷却阶段

温度下降速率（℃/分）对SAM和过热水灭菌，系重要控制参数 压力下降速率 装载物的冷却时间

若需要，可以保护包装的完整性 可获得合理的产品卸载温度

产品最终灭菌最重要的是建立合适的灭菌程序，以保证装载物冷点的产品获得足够的杀灭力，同时能保证装载高温度点的产品在有效期内的稳定性。因此，灭菌程序的验证要注意以下几点：

¾ 将装载方式列入灭菌程序，或在相应的SOP中做出规定；

21

¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ 只能采用经验证的程序；

灭菌介质符合灭菌器性能确认的要求；

进行生物指示剂挑战试验，建立日常监控的微生物限度标准； 适当的空气超压，以使产品的破损和变形减小到最低程度； 允许装载物的有效冷却，以保证产品的质量；

灭菌器腔室内的托盘和支架应根据产品和灭菌方式确定；

8.1.3 重力置换法

重力置换程序建立在如下的理论基础上：在灭菌温度下，腔室中的冷空气的密度约是蒸汽的1.6倍，冷空气沉降在腔室的底部。蒸汽进入腔室的时候，空气和冷凝液一起从腔室底部经疏水阀排出。排除空气过程与疏水器的准确运行和适当的蒸汽分布相关。蒸汽一般通过导流板或多孔管注入灭菌器腔室，如果进蒸汽的速度过大或者没有合理分布，装载物的顶部附近可能会产生空气残留，如果蒸汽增加得过于缓慢，空气可能会被加热而混入蒸汽中，从而使空气去除更加困难。重力置换去除空气的效率低于其他方法。这类灭菌器的使用，务须严格验证。

温度计压力表蒸汽进蒸汽档板空气排放

重力置换式灭菌器工作原理图

生产线上大型的重力置灭菌器已趋淘汰趋势，但小的实验室还有一些手提式的灭菌器，工作原理与工业化的灭菌器有所不同，简言之，手提式的灭菌器有如家用的高压锅。

8.2 多孔/固体物品的灭菌

用于注射剂生产的部分辅助物料在生产过程中与药品直接接触，因此同样需要灭菌。它们包括：过滤器、胶塞、胶管、服装、不锈钢器皿、填充机械部件、清洁用品等等。一般通过与饱和蒸汽直接接触而实现灭活，湿热蒸汽的能量通过传导或对流传递热量。这类物品的耐热性好，一般采用过度杀灭或更为安全的灭菌程序。这类物品，获得无菌保证的良好重现性的最大障碍是物品中潜在的空气，所以适合的灭菌过程是先采用预真空过程，然后饱和蒸汽灭菌的方法。预真空有高真空和脉动真空灭菌二种，前者只是使用在个别的场合，脉动真空灭菌的应用十分普遍。

22

对于脉动真空灭菌程序而言，要注意装载不宜过多，过密，被灭菌品一般应有适当的包装，但包装应能透气，以保证抽真空及蒸汽穿透的效果。灭菌过程开始之前对装载物的抽真空处理是很重要的。如果每次的真空度为-0.1个大气压，那么每个脉冲将使灭菌器内的空气减少90％或者1个对数单位，三个脉冲（蒸汽注入高于大气压，以避免空气进入灭菌腔室），剩余的空气量只有0.1%了，这对蒸汽的穿透就比较有利。

然而，灭菌的能量来自蒸汽冷凝所放出的潜热，不要认为残留空气少了，灭菌就一定完全。还需要检查灭菌器的排水和排气，确保畅通。例如，破碎的玻璃屑或其它物品可能堵住排水口，结果腔室压力是保持了，但蒸汽的放热过程受阻，可能影响装载灭菌后的最终无菌状态。

在脉动真空灭菌器使用过程中，目前存在一些疏漏，这主要是指一部分企业的生产车间或实验室的单扉灭菌柜。疏漏表现在二个方面：一是卸载时的装载温度偏高，例如，除菌过滤、手套、工作服等，经灭菌后，在80℃左右即卸载，以节约时间，然而，人们忽视了周围的空气不是无菌的，装过滤器的不锈钢盒及装工作服的枕套一类保护性用品，根本挡不住微生物随着常温空气的侵入，从而造成已灭菌品在处理及传输过程中再次污染；另一种情况是此灭菌器不宜用于大容量的液体产品，如将密封的液体产品放在其中灭菌，可能会造成瓶子炸裂等严重后果。

对于多孔/固体物品的灭菌，需要确定以下操作参数（但不仅限于此）：

灭菌阶段

控制参数

对参数的说明

外壳温度不能超过或者明显低于灭菌器腔

室的灭菌温度。要控制温度避免过度加热或过度冷却。

必须，记录仪带有合适尺寸的记录纸以便记录灭菌程序全部的温度/压力变化值

监控探头/记录探头

，无纸记录仪能记录灭菌程序全部的温度/压力变化值，并具备异常报警功能。参数的记录能通过记录仪显示。存贮信息可通过计算机打印。

用于多孔/坚硬物品灭菌时的空气去除

外壳温度/压力

灭菌程序全部

真空/脉冲的次数、范围和持续时间（若使用）

加热阶段

正压力脉冲的次数、范

用于在灭菌程序开始之前控制装载物

围和持续时间（若使用）腔室加热

对于饱和蒸汽的灭菌方法，可以根据温度

和压力的变化设置报警点

对每个灭菌程序都是重要的控制参数 对每个灭菌程序都是重要的控制参数 对每个灭菌程序都是重要的控制参数

灭菌阶段 灭菌时间 灭菌阶段的温度 灭菌阶段的腔室温度波动

23

F0值的累积 干燥时间

冷却阶段

真空解除速率

对于灭菌器自带的测量探头，最小F0值的记录有利于灭菌程序的评价

可以选择加热、真空等手段来干燥装载物 若需要，可以用来保护包装或过滤器的完整性

若最后采用喷淋水降温，则必须监控喷淋水的质量。但是多孔/坚硬物质不适合采用喷淋水降温，一般采用抽真空或夹套降温。比如过滤器，胶塞，胶管，服装，不锈钢器皿，填充机械配件，清洁用品等等。

对于多孔/坚硬物质的灭菌装载方式，需要注意以下几点： ¾ 装载物的类型和结构要加以确认并记录在案； ¾ 装载物不能接触到灭菌腔室内壁；

¾ 金属箱表面与底座之间的接触应减小到最低程度，通常使用有孔的支架，必要时也可以

用可调节的支架；

¾ 为了便于空气去除，冷凝水排出和蒸汽穿透，要明确地确定装载物的方位并记录在案； ¾ 质量大的装载物应放置在灭菌器中较低的架子上，以尽量减少被冷凝水弄湿； ¾ 控制灭菌器中物品的数量，如果装载物的大小能够改变，则需要确定最小和最大的装载

物，确认中间装载物的合理插入法应包括最低负载中的最难灭菌物品；

¾ 如果确认研究表明物品的位置不影响灭菌效果，那么装载的形式可能是可变的； ¾ 装载记录可以作为操作人员的参考。

九、灭菌工艺的验证及验证文件

9.1灭菌工艺验证的步骤

灭菌过程的验证和常规控制的相关内容包括灭菌设备的确认、灭菌工艺的验证。由于灭菌器可能会用于多个产品的灭菌，并且各产品的热稳定性、热容和灭菌工艺参数不全相同，本指南认为灭菌器的设备确认和产品灭菌程序的验证二者概念及要求各不相同，应分开处理。

9.1.1 在灭菌程序验证开始之前，应先对灭菌器进行确认，确认的内容及文件一般包括：

9.1.1.1 安装于蒸汽灭菌器的空气过滤器的泄漏试验、进行挑战性试验的周期、空气流速； 9.1.1.2灭菌设备的容积、真空度、压力以及泄漏率测试；灭菌设备如有夹层，夹层与腔室之间的压力与温度的安全范围；如灭菌设备中装有蒸汽分流器，则必须消除系统运行安全的风险；

9.1.1.3蒸汽质量测试（若必需）、例如：用什么作为灭菌介质（如蒸汽、压缩空气、过热水等）并能证实有效；

9.1.1.4使用何种类型的监测和控制传感器？如何校正？是否符合相关规定？对升温时间的控制（若必需）、时间、温度、压力、压力消减速率的控制（若必需）；空气质量、水质量的

24

控制以及报警（若必需）；对保温阶段（灭菌阶段）内的温度波动范围如何控制？生物指示剂（化学指示剂）的挑战性试验以及不同装载的验证； 9.1.1.5对灭菌器进行热分布/热穿透测试仪器的核准等；

9.1.1.6完成IQ/OQ/PQ的方案，以及具备证实能够进行IQ、OQ和PQ的所有内容并能对偏差进行处理及纠正的能力等。

9.1.2 一般来说：灭菌程序的性能验证（PQ）必须包含：

9.1.2.1 空载热分布试验 9.1.2.2 满载热分布试验

9.1.2.3 热穿透和生物挑战试验

包含每种装载容器的每种装载方式；每种方式的运行次数；每种方式的冷点是否确定 等，以及出现热穿透偏差如何处理；若在同一灭菌柜上进行多产品多规格的灭菌再验证时，鼓励采用风险分析的方法，筛选出最有效、最经济的验证方案。 9.1.2.4 升温、降温速度对生产工艺、产品的影响；

9.1.2.5 喷淋冷却速度对被灭菌产品的影响；冷却用水是否能有效地控制微生物；

9.1.2.6 温度测量系统（包含灭菌器的温度传感器和验证用多点温度测试仪）是否提供每一个测点的打印数据；温度测量系统是否都进行校准；温度测量系统的校准是否符合相关法规和标准的规定；

9.1.2.7 生物指示剂的使用：包括类型；来源；D值；是否采用残存概率法？必要时，应提供污染菌（生物负荷）的特性及鉴别资料；生物负荷的报警及采取措施的限度；生物指示剂的鉴别、耐热性及稳定性；将污染菌与生物指示剂耐热性进行比较；进行生物指示剂挑战性试验，用冷点（如产品处在生物指示剂最难杀灭的位置或它属于最难灭菌的产品或二者兼备的情况）的数据，来确定最短灭菌程序的控制参数； 9.1.2.8 对过度杀灭的风险分析及管理；

9.1.2.9 灭菌后的干燥程序对灭菌效果的影响；

9.1.2.10 研究产品耐受性变更导致的灭菌工艺变化； 9.1.2.11总体评价并指导最佳灭菌效果的装载量； 9.1.2.12 验证及其相关项目的培训等。

9.1.3 对于灭菌工艺的验证，应符合以下规定：

9.1.3.1 在升温阶段，同一时间内最低温度、最高温度与平均温度偏差≤±2.5℃；在保温阶段（灭菌阶段）同一监测点在全过程中温度波动应≤±1.0℃（设备的温度控制能力和测试精度的反应）；同一时间各监测点与平均温度的最大偏差≤±1.0℃（装载区内温度的均匀性表现）；对饱和蒸汽灭菌器而言。保温阶段腔室内压力波动应在±5kPa之内；

9.1.3.2 灭菌工艺验证包含最小装载、满载和典型装载三种；或者采用最大装载，最小装载和混合装载的兼容性研究，后者适用于多孔/固体物品的灭菌； 9.1.3.3 建议空气过滤器的流速应不大于0.13kPa/min（若必需）；建议进行空气移除速度的检查（若必需，适合多孔/固体物品）；

9.1.3.4 生物指示剂的放置宜根据被灭菌产品的情况而定；除了在灭菌器腔室内均匀布置外，一般还应考虑放置在最难灭菌部位，如接近冷凝水排放点的位置，过滤器的中心，其它产品内的几何中心等。必要时，需测被灭菌物品的初始菌（生物负荷）数据； 9.1.3.5 建议以冷点温度作为程序控制的依据；即确认所有测点均达到灭菌温度后才计算标准灭菌时间。

25

9.2验证文件

9.2.1相关文件要点

以下是对蒸汽灭菌器或湿热灭菌工艺的相关验证文件的示例性说明，由于湿热灭菌的范围不局限于饱和蒸汽灭菌，企业可以根据自己的实际情况决定取舍，但必须评估相关内容是否完整：

y 为便于培训、确认和实施验证试验，有必要绘制出灭菌器及相关管线及控制点的示

意图。灭菌程序的SOP及验证方案中，均应有此示意图，以方便培训、讨论和检查。

y 灭菌器制造商及其设备信息； y 灭菌器的安装确认报告（企业应有专业人员参与，以了解并掌握安装中出现的问题

和解决办法，此原则适用于以下灭菌程序验证前的所有活动）；

y 首次灭菌的情况、所有操作及控制文件，包括仪表、阀门、报警装置以及相关设施

的校准等；

y 产品的安全耐受性测试报告

y 真空度以及压力保障措施的确认试验报告 y 泄漏率测试报告

y 蒸汽、水、压缩空气等辅助系统的质量测试报告

y 包含冷点、装载分布、热分布、热穿透等项目研究的IQ、OQ、PQ方案及报告 y 对验证结果的总结和风险分析，并确定装载方式（须列入SOP或其它适当文件）

报告

y 完整的操作记录（也可以是表格、文字或二者的结合） y 维护保养程序以及记录，包含预防性维护、条件维护等内容 y 任何变更、任何故障的处理报告 y 培训记录以及效果评价报告 y 再验证周期的规定 y 其他

9.2.2验证文件要点

y 灭菌参数与被灭菌物品特性的确认 y 真空度（泄漏率）

y 蒸汽灭菌的初始菌控制（灭菌前物品的生物负荷的数量） y 蒸汽灭菌中对于水、空气过滤器等的要求 y 产品的安全耐受值 y 对过度杀灭的 y 挑战试验

y 密封可靠性试验 y 再验证周期

y 新的灭菌工艺的开发 y 验证实施步骤

y 偏差处理、风险分析以及验证报告 y 其他

26

9.3水喷淋式灭菌器验证方案示例

水喷淋式灭菌器在大容量注射剂生产中应用十分广泛，它是湿热灭菌中的重要关键设备。灭菌器一般采用纯化水或注射用水作为加热、灭菌和冷却介质，可以有效防止产品灭菌后的二次污染。它以过热水在灭菌器腔室内循环对产品不断均匀地喷淋来达到灭菌的目的，同时，借助于洁净压缩空气的作用保持腔室内处于适当的压力状态而防止水的汽化，在保证被灭菌产品受热均匀性的同时，又通过自动控制系统确保产品受热时内外压力的基本平衡，减少产品在灭菌过程中破损或密封损伤。

常规的验证工作有以下几个步骤；

A：设立验证的组织机构（验证小组等）；

B：制定验证计划，确定所需的仪器设备、系统、过程和进度时间表；

C：制定验证方案，必须确定有可操作性的验证方法；包括验证目的、适用范围、系统或设备、验证应完成的试验、核准和/或检查、可接受标准、实施步骤等 D：按照验证方案实施；

E：收集验证数据，出具验证报告，包括验证结果、偏差处理、验证评价和建议，再验证周期等。

验证的组织机构（验证小组）开始工作以后，首先要确定灭菌器的方案起草、会签人员等。方案批准后方可实施。

灭菌器的验证包含预确认、安装确认、运行确认和性能确认（产品灭菌工艺的确认，性能确认时，被灭菌液体产品可用适当的替代品）等几个阶段。

预确认方案具备以下内容：

首先应根据产品的工艺来考虑灭菌器的选型，主要是装量的大小、灭菌温度与时间的可控制性、灭菌程序的可选择性、灭菌时腔室内温度的一致性、升温与降温速率的稳定性、控制及记录系统的可靠性等。

安装/运行确认的重点：

是否符合设备本身的验收标准、安全标准以及国家相关法规（包含压力容器）的规定；电源、真空、压缩空气、冷却水等公用系统的验收和对灭菌器运行的适用性；各种附件、备件、可清洗件是否完整以及记录；辅助设备（如纯蒸汽发生器、空气过滤器等）的性能检查等；仪器仪表的校准；设备的维护保养手册/培训手册/操作手册是否完备；监控探头/记录探头/报警装置的验收等。

性能确认（产品灭菌工艺的确认）具备以下内容： 见本指南9.1。

验证方案包含以下内容，但不仅限于此：

1, 引言：包含概述和验证目的、验证依据、可接受标准、验证小组人员及其职责等。 概述中应对被验证灭菌器的选型、功能以及是否符合灭菌工艺参数进行描述； 验证目的则陈述验证要达到的几项指标，也可以包括挑战试验的内容。例如： －检查并确认该设备所用材质、设计、制造符合GMP要求 －检查该设备的文件资料齐全且符合GMP要求

－检查并确认设备的安装符合要求，公用工程系统配套齐全且符合设计要求 －确认该设备的各种仪器、一般经过校准合格并有相应证书 －确认该设备的各种控制功率符合设计仪器

－确认该设备在稳定的操作范围内能稳定的运行且能达到设计标准

27

－确认该设备的灭菌能力达到工艺要求 －为设备维修、改造和再验证提供数据资料

2, 安装确认： 2.1 文件的确认

文件名称 操作手册 安装计划 维修指南 备件清单 压力容器检验

文件编号

存放地点及保管人

操作SOP 培训记录 安装竣工图 电路及控制系统图 辅助设施清单及性能报告

2.2 主要部件检查（最好填写详细信息、型号等） 部件名称 腔体 水喷淋设施 热交换器 循环泵 空气过滤器 灭菌车 监控探头 记录探头 其他

2.3 安全系统检查（最好填写详细信息、型号等） 部件名称 腔体安全阀

设计指标

28

设计指标

型号及材质确认

结论及文件编号

检测报告及编号

结论

门封条 门封压力控制系统 压缩空气连锁 腔室压力开关 报警系统 温度开关 紧急制动开关 水位控制开关

其他

2.4 仪表的检查与校验（最好填写详细信息、型号等） 部件名称 温度记录仪 温度监控/记录或压力监控/记录探头

压力表 温度表 其他

生产厂家

校准/检定证书及编号

结论

2.5 公用系统的连接检查（最好填写详细信息、型号等）

名称 电源电压 压缩空气 水（接触产品）

蒸汽

冷却水（不接触产品）

管道材料/连接 蒸汽过滤器 冷却水过滤器 真空系统

设计指标

安装情况及检查文件编号

结论

29

其他

2.6 控制系统检查（最好填写详细信息、型号等） 部件名称 模拟输入 模拟输出 数字输入/输出 PLC模块 通信卡 打印机 软件 记录仪/纸 无纸记录仪

其他

3, 运行确认（功能测试） 包含各报警的模拟确认、各项安全或互锁装置的确认、密封性测试、升温/降温程序测试、产品进出灭菌器系统的测试、以及对规定的灭菌程序进行测试等、确认符合规定。

4, 性能确认（产品灭菌工艺的确认）

包含验证依据、接受标准、验证小组人员及其职责等。 4.1 热分布试验

空载：必须包含测点位置图和接受标准、温度记录等，通过数据找到冷点。 装载：与上相同，但包含最小装载、典型装载和最大装载三种，每种重复三次。 计算F0值，结果分析与评价。

4,2 热穿透试验（可与生物指示剂挑战试验同时进行）

装载：必须包含测点位置图和接受标准、温度记录等，通过数据找到冷点。但宜包含最小装载、典型装载和最大装载三种，每种重复三次。注意，旋转灭菌器无最小装载试验，因为灭菌车上只有单独的最小装载时，在旋转中易损坏设备，实际试验时，往往是最小装载和模拟产品的混合物（有特殊标识），即运行时是满载的，以保证旋转过程的稳定性。可以将模拟品与实际产品进行对照试验，如果二者的热穿透特性相同，则装载物可不一定全部采用实际产品而采用已经过对照试验的模拟品。不过，被测试的产品，如插入温度探头或接种生物指示剂的产品，必须是实际产品。 计算F0值，结果分析与评价。

4.3 密封完好性试验

可采用微生物侵入法或其它适当方法进行试验 4.4 偏差分析

30

型号或系列号

设计指标及检查文件编号

结论

偏差报告表

测试中出现偏差的位置:

偏差描述:

发现偏差人/日期:

审核人/日期: 偏差号.

调查结果, 整改措施和总结:

填写人/日期: 负责人:

预计解决日期: 审核人/日期:

总结:

编写人: 批准人/日期:

日期: 批准人/日期:

工程部 质量保证部

注: 如因篇幅需要复制本表，应注明页码及总页数

4.5测试记录表

测试项目清单 空载热分布

完成人/日期

31

检查人/日期

是否符合

备注

装载热分布（最小装载） 装载热分布（典型装载）

装载热分布（最大装载） 热穿透试验（最小装载） 热穿透试验（典型装载） 热穿透试验（最大装载） 生物指示剂挑战试验

注：表中的典型装载系指最常采用的装载及装载方式。

4.6 参加验证人员清单

姓名

4.7 报告附件清单 文件名称 人员资质证书 验证依据 原始记录 仪器校准报告

页数

备注

职务

参加项目

签字

备注

十、附表

表1. 热力灭菌工艺常用的生物指示剂 灭菌方式 湿热121℃

微生物（孢子）

嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus

32

D值范围（min）

1.5-3.0

枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 梭状芽孢杆菌 Clostridium sporogenes

干热 150℃

枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var. niger

0.3-0.7 0.4-0.8 0.4-0.8 >1.0

资料来源：Fundamentals of thermal sterilization processes by Richard T. Wood, Ph.D 1999-12

表2. USP30生物指示剂数据参考表

典型D(分) 示例

1.9

生物指示剂 D值选择范围 (分)

灭菌方式 干热灭菌a160 ℃ 环氧乙烷b600 mg per liter 54℃ 60% RH Moist Heatc

121℃

a

适当的耐热性限度 由具体的D值确定 （分) 存活时间 Min. 4.0 Max. 14.0 Min. 10.0 Max. 27.0 Min. 4.5 Max. 14.0

杀灭时间 10.0 32.0 25.0 68.0 13.5 32.0

Min. 1.0 Max. 3.0 Min. 2.5

3.5

Max. 5.8 Min. 1.5 Max. 3.0

1.9

For 1.0 × 106 to 5.0 × 106 spores per carrier. b

For 1.0 × 106 to 5.0 × 107 spores per carrier. c

For 1.0 × 105 to 5.0 × 106 spores per carrier.

表3 饱和蒸汽和过热水特性表

饱和蒸汽及过热水的性质（公制）

温度 压力 热焓（内热）J/g ℃ 巴** 水hL∆h* 蒸汽

100 1.013 419 2256 2675 115 1.692 483 2216 2699 120 1.987 504 2022 2706 121 2.026 508 2199 2707 125 2.322 525 2188 2713 * 冷凝或蒸发的潜热（∆h=hv-hL）,

** 1.0大气压=1.013巴=14.71psia （磅/英寸2） 1cal = 4.1868J (卡指国际蒸汽表卡)

表4 湿热灭菌中不同温度和Z值下的杀灭率(L)值

T(℃)

L值

Z＝7

Z＝8

Z＝9

33

Z＝10 Z＝11 Z＝12

100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 114.5 115 115.5 116 116.5 117 117.5 118 118.5 119 119.5 120 120.5 121 121.5 122 122.5 123 123.5 124 125 126 127 128 129 130

0.001 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.007 0.010 0.014 0.019 0.026 0.037 0.052 0.072 0.100 0.118 0.139 0.1 0.193 0.228 0.268 0.316 0.373 0.439 0.518 0.611 0.720 0.848 1.00 1.18 1.39 1. 1.93 2.28 2.68 4.39 5.18 7.20 10.0 13.9 19.3

0.002 0.003 0.004 0.006 0.007 0.010 0.013 0.018 0.024 0.032 0.042 0.056 0.075 0.100 0.133 0.154 0.178 0.205 0.237 0.274 0.316 0.365 0.422 0.4 0.562 0.9 0.750 0.866 1.00 1.16 1.33 1.54 1.78 2.05 2.37 3.16 4.22 5.62 7.50 10.0 13.3

0.006 0.006 0.008 0.010 0.013 0.017 0.022 0.028 0.036 0.046 0.060 0.077 0.100 0.129 0.167 0.190 0.215 0.245 0.278 0.316 0.359 0.408 0.4 0.527 0.599 0.681 0.774 0.880 1.00 1.14 1.29 1.47 1.67 1.90 2.15 2.78 3.59 4. 6.00 7.74 10.0

0.008 0.010 0.013 0.016 0.020 0.025 0.032 0.040 0.050 0.063 0.079 0.100 0.126 0.158 0.200 0.224 0.251 0.282 0.316 .355 0.398 0.447 0.501 0.562 0.631 0.708 0.794 0.1 1.00 1.12 1.25 1.41 1.59 1.78 2.00 2.82 3.16 3.98 5.01 6.31 7.94

0.012 0.015 0.019 0.023 0.028 0.035 0.043 0.053 0.066 0.081 0.010 0.123 0.152 0.187 0.231 0.257 0.285 0.316 0.351 0.390 0.433 0.481 0.534 0.593 0.658 0.731 0.811 0.901 1.00 1.11 1.23 1.37 1.52 1.69 1.87 2.31 2.85 3.51 4.33 5.34 6.58

0.018 0.022 0.026 0.032 0.038 0.046 0.056 0.068 0.083 0.100 0.121 0.147 0.178 0.215 0.261 0.287 0.316 0.348 0.383 0.422 0.4 0.511 0.562 0.619 0.681 0.750 0.825 0.909 1.00 1.10 1.21 1.33 1.47 1.62 1.78 2.15 2.61 3.16 3.83 4. 5.62

资料来源：药品生产验证指南 2003

34

十一、附件-蒸汽质量测试法

蒸汽质量的测试方法（节选） ……

9.0 蒸汽质量 引言

9.1 饱和蒸汽灭菌及某些环氧乙烷灭菌的增湿需连续提供饱和蒸汽。不凝性气体含量过高时

蒸汽进入腔室膨胀时，它可能导致过热2，将难以保持灭菌条件；在蒸汽中1湿气过低条件下，

而当湿气过高时，它可成为被灭菌品。

9.2 所有这些蒸汽质量的试验，都应当从每个灭菌柜的供汽管路抽取蒸汽样品。当蒸汽进入腔室并在蒸汽用量最大时进行测试。

9.3 在这些试验中不应采用硅胶管，因它们属多孔性的材料，会夹带蒸汽。

不凝性气体的测试

9.4 此试验用以证明在蒸汽中不凝性气体的含量水平不会影响装载任何部分的灭菌条件。（不凝性气体可能的来源见HTM第2部分）。所述方法并非是对不凝性气体含量准确值的测试，但此测试可证明蒸汽达到了质量要求。 9.5 图9描述了测试装置。图中的规格为名义尺寸。 9.6 将针形阀与图9中的蒸汽管联接。

9.7 将仪器装好，以致冷凝水可以从长管自由地进入取样管。如果管子太短，也可以使用铜管或不锈钢管。

9.8 容器中加入冷水直到溢出。滴定管及漏斗中注入冷水，将其以倒置方式放入容器。排尽滴定管中可能存在的任何气体。

9.9 将取样管从容器口移开，打开针形阀，并让蒸汽进入，排除管中的空气。将取样管放入容器内，使其一端在漏斗内，加入更多的冷水，直至水通过溢流管从容器溢出。 9.10 将空的量筒放在溢流管的下方。

9.11 调节针形阀，使连续的蒸汽流通过，以致能听到小的“汽锤”声。保证所有排出的蒸汽进入漏斗，无蒸汽的气泡进入容器。在调节好的阀门上做好标记。关闭阀门。 9.12 保证容器满载冷水且测定的量筒是空的。将滴定管中的空气排尽。

9.13 除腔室的常规设备外，要确保灭菌柜腔室的无装载状态。选择并开始运行程序。

1

译注：英文原文采用了suspension一字，这里的所谓蒸汽实际是蒸汽、不凝性气体和湿气汽的混合物。

2

译注：过热在一定程度上就成了干热灭菌，影响灭菌效果。

35

9.14 当蒸汽第一次开启时，将针形阀开至以前作好标记的位置，使连续的蒸汽样品足以听到小的汽锤声。

9.15 让蒸汽样品在漏斗中冷凝。任何不凝性气体将升至滴定管的顶部。生成的冷凝水溢出，被气体置换的水收集于量筒中。

自行排水管

蒸汽供汽

a- 粗刻度为1亳升的50ml滴定管 b- 名义口径为50ml的对称漏斗

c- 大小与漏斗及滴定管相匹配的胶管 d- 在1500ml处溢流的2000ml容器

往灭菌柜 e- 直径6mm，75mm处向上的蒸汽取样管

f- ¼英制针形阀

g- 粗刻度为10ml的250ml量筒 h- 滴定管支架 i- 胶管

j- 粗刻度为1℃的温度计（0-100℃ ）

通疏水器k- 溢流管

图9 不凝性气体测试装置

9.16 当容器中的水达到70-75℃时，关闭针形阀。记下滴定管中收集气体的体积Vb和量筒中收集到水的体积Vc。

9.17 按以下方法计算不凝性气体的百分比：

不凝性气体的比例=100 ×（Vb/Vc）

36

9.18 如果不凝性气体的百分比不超过3.5%，则可作合格论。

9.19 应进行2次以上的试验，以确定试验结果的一致性。如果三次测定的结果有明显差异，则须查明原因后作进一步测试。

过热值测试

9.20 本试验用于证明供汽蒸汽中3悬浮湿汽的量足以防止进入腔室膨胀时蒸汽出现过热。 9.21 本试验方法采用小体积样品，从蒸汽的供汽管中心连续取样。由于在管内的冷凝水没有加以收集，因此，不能将本法测得的过热水平视作管路中蒸汽干燥值的准确指标。然而，如果在腔室的供汽系统中考虑设置了分离冷凝水的装置，那么，这种方法测定的过热水平就很可能能够代表腔室灭菌阶段的总体水平。

9.22 此项测试通常应在不凝性气体测试结果合格后进行。

9.23 本项测试及下述的干燥值测试要求采用图10所示的皮托管。安装方式见图11。所有规格均为名义尺寸。

9.24 按图11将皮托管安装在蒸汽管的中心。

9.25 将探头的密封管插入供汽管中。其中的一个探头要安装在管道的轴心位置。 9.26 将第二个探头的密封管装入膨胀管并将其置于轴心位置。在膨胀管外加上防护套。将管推至皮托管上。

蒸汽压

孔径‘A’

直径6mm 的皮托管

银焊

图10 皮托管

3

译注：同1，包括不凝性气体、湿汽及蒸汽。

37

蒸汽供汽管

皮托管

温度探头适配器 膨胀管

接温度测试仪

接灭菌柜

膨胀管

压入管中尼龙衬套

‘A’- 用适当的装置将温度探头 放入管中

为减小配件和温度探头间的热 转移，可能需要保温

图11过热值测试装置

9.27 除腔室正常的设备外，确保灭菌柜处于空态。选择并启动运行程序。

9.28 从测试的温度中，记录蒸汽管中的温度（用于干燥值测试）及当向腔室刚开始供汽时膨胀管中的温度Te，按下式计算过热值： 过热值=Te-T0

式中T0 是当地大气压下水的沸点

9.29 如在膨胀管中测得的过热值不超过25℃，测试即作合格论。

38

干燥值测试

9.30 对蒸汽中水分含量的准确测定是很困难的，在传统的方法中要求有持续的蒸汽流，但这不适用于灭菌柜。本项测试可能无法获得蒸汽中准确的湿汽值，但这种测试可以证明蒸汽达到了供汽要求。在热技术备忘录的第二部分，对湿度可能超标作了讨论。 9.31 试验通常在过热值测试后立即进行。

9.32 本项测试要用图10中所示的皮托管。试验装置见图12。所有的尺寸都是名义尺寸。需要一个实验室用的天平，能称2kg，精度至0.1g或性能更优。

9.33 如还没有安装，则应将皮托管安装入蒸汽供汽管的中心位置（见图12）。

9.34 如还没有安装，则应将温度探头密封管装入蒸汽的供汽管，再在管道的轴线位置插入温度探头。

蒸汽供汽管

皮托管

能自行排水长度为 450±50mm的胶管

温度探头 密封圈

胶塞 组件

通往灭菌柜

通往温度 测试仪

热电偶及通气用管道

1立升的 真空瓶

取样管 胶塞组合件

玻璃管外径6mm

图12 干燥值测试装置

39

9.35 将胶管与胶塞中的长管相联，并将胶塞放在真空玻璃瓶的瓶颈处，称重并记录总的质量M1

9.36 移除胶塞和管道组合件，并注入低于27℃的冷水至刻度650±50mm。将胶塞和管道组合件放回原处，称重并记录质量M2。

9.37 将瓶子靠近皮托管，保证胶管和玻璃瓶没有受过热及气流的影响。但此时还不需要将它和皮托管联接。

9.38 通过2个管中的短管，引入第二个温度探头至瓶中的冷水。记录水温T0。 9.39 除正常的部件外，保证灭菌柜处于空态。选择并启动运行程序。

9.40 当腔室的供汽蒸汽刚打开时，将胶管与皮托管排放口相接并保温，调节好的胶管方位，以使冷凝水能自由排放，记录供汽蒸汽管温度Ts。

9.41 当瓶中水温达80℃时，将胶塞管脱开皮托管，将瓶振摇，使内容物完全混合，记录水的温度T1.

9.42 将瓶及胶塞件称重，记录质量M39.43 瓶中初始水的质量Mw=M2-M19.44 所收集冷凝水的质量Mc=M3-M29.45 按下式计算蒸汽的干度值

D=

式中：

(T1-T0)(4.18Mw+0.24) 4.18(Ts-T1)

-

LMcL

T0=瓶中水的初始温度 T1=瓶中水及冷凝水的最终温度 T3=向灭菌柜供汽蒸汽的平均温度 Mw=瓶中水起始的质量 Mc=收集到的冷凝水的质量 L=干蒸汽在温度Ts(KJkg-1)下的潜热

9.46 对此等式的偏差以及对假设涵义的讨论请见附录2 9.47 如以下要求得到满足，则测试符合要求

a.干燥值不低于0.90（如是灭菌金属载体，则干燥值不应低于0.95）

b.在整个运行周期中，供汽管中蒸汽的温度与过热值测试膨胀管中测得温度间的温差应

在3℃之内。

文献；HTM2010（Health Technical Memorandum 健康技术备忘录）

40

十二、参考文献

1) PDA Validation of Moist Heat Sterilization Processes: Cycle Design, Development

Qualification and Ongoing Control Technical Report No. 1 (2007 Revision)

2) Guidance for Industry for the Submission Documentation for Sterilization Process Validation

in Applications for Human and Veterinary Drug Products (November 1994)

3) Guidance for Industry：Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing -- Current

Good Manufacturing Practice（September 2004）

4) Quality assurance of pharmaceuticals Volume 2, 2nd updated edition Good manufacturing

practices and inspection, Sterile pharmaceutical products WHO 2006

5) EU Guidelines to Good Manufacturing Practice Medicinal Products for Human and

Veterinary Use Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products 2008-02 6) GB 18278 《医疗保健产品灭菌 确认和常规控制要求 工业湿热灭菌》 7) British Standard BS EN 285:1997 Sterilization-Steam sterilizers-Large sterilizers

8) HTM2010 issued by UK HHS Estates（An Executive Agency of the Department of Health）

41