实验方案
题 目： 水环境中的铜对不同发育时期河虾的毒性研究 指导老师： xxx 专 业： xxx 班 级： xxx 学 号： xxx 姓 名: xxx
水环境中的铜对不同发育时期河虾的毒性研究
一．实验意义：
拟利用河虾作为研究对象，建立一套完整的研究方法，较为彻底地弄清环境中同化的
Cu在经济甲壳动物体内累积的特征。特别是Cu的营养或毒性作用对肝胰腺结构、生理和生化功能的影响，以及伴随这些影响而导致的血淋巴的主要生化成分的变化、PH值，以及X-器官窦腺复合体和Y-器官的结构及与蜕皮相关联的激素分泌功能的变化。
二．重点研究内容：
1. 环境中同化的Cu对甲壳动物蜕皮机制的影响。 2. 环境中同化的Cu对甲壳动物性别决定机制的影响。
三．实验设计思路：
实验设计流程图
蜕皮前期 蜕皮间期 蜕皮期 幼体阶段 河虾 仔虾阶段 蜕皮后期 摘取测定器官 鳃 肝胰腺 触角腺 生殖腺 血淋巴 外壳 组织 切片和 电镜 组织切片和电镜 生化物质 铜钙分布 生化物质 铜、钙分布 ATPase PH 三．实验设计框架图 实 验 步 酶 血蓝蛋白 蜕皮酮 水环境中的铜对河虾不同生长时期的急性毒性试验 消化酶 代谢酶 MT 形态学研究 添加额外的铜对河虾生长的存活率、增重率、蜕皮率影响的研究 添加额外的铜对河虾相关器官、组织形态影响的研究(光镜、电镜)
四．补充方案：
1． Cu对河虾主要组织器官同工酶的影响：（拟选取酯酶同工酶研究） 、
2。Cu对河虾总DNA的损伤：
河虾 不同浓度Cu处理 染毒动物 解剖、取材 肝胰腺 鳃 精巢 卵巢 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Brewer法染色 凝胶成像、扫描分析
琼脂糖电泳凝胶检测 随机引物扩增PCR ( RAPD ) 河虾 不同浓度Cu处理 染毒动物 总DNA的提取 随机引物的选取与合成 凝胶成像分析仪分析数据 五．部分实验方法
1．急性毒性试验：
实验前测定自然水域中的铜离子浓度，按设计浓度配好浓度梯度后，再次测定溶液中的铜离子浓度进行确认。
1) 预备试验,：确定试验药物的质量浓度梯度。在试验中 ,设 7个质量浓度处理组（mg/L（0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 200 ）和 1个对照组 ,每组另设2个平行组。在各组中试验动物随机分配, 加入铜的质量浓度梯度 (mg/ L)待定。在每只水族箱中分别加入含有铜离子的水, 然后立即加入实验动物(雌雄比为1:1)，试验期水温为自然水温，自然光照，定期充气。死亡标准待定，记录各组 24 h, 48 h, 72 h和 96 h的死亡数。由于试验期间虾存在自然死亡，为消除此因素的影响，用公式加以校正，即 : P=(P’ – C) / ( 1 – C), 其中：
P—校正后的试验组死亡百分数 ; P’—校正前观察死亡百分数 ;
C—对照组死亡百分数 ,同时将校正后的对照组死亡百分数均计为 0。 2) 半致死质量浓度用下式计算 :
LC50 =[C1 +(50 %- P1 ) / (P2 – P1 ) ]× (C2 – C1 ) , 其中：
C1 、C2 —分别为死亡百分数接近 50 %的低端质量浓度和高端质量浓度 ; P1 、P2 —分别为相应的死亡百分数。 安全质量浓度由下式计算 :
安全质量浓度 =48LC50 × 0 . 3 / (2 4LC50 / 48L C50 )长期安全浓度 =96L C50 × 0 . 1
2． 存活率、增重率蜕皮率的测定：
实验采用单因素梯度法，铜离子浓度分为8个梯度(mg/L):0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，另设一高浓度铜组，待定。每个浓度共设10个平行(雌雄比为1:1)；分别置入水族箱中，每日换相同铜离子浓度的的水1次，换水量约为1/4；每天定时投饵。实验每日测水温、pH、各1次。实验观察和数据处理：每次换水时观察并记录罗氏沼虾发育进程和数量、蜕皮次数，并对各组存活率、增重率进行显著性检验，存活率、增重率及饵料系数按以下公式计算：
存活率(SR)=n/N×100% 增重率(GR)=(Wt－W0)/ W0×100% 饵料系数(FC)= W/ (W t －W0)×100%
其中：n为存活至下一发育期仔虾数，N为起始虾数
W0为实验前虾平均体重，Wt为实验后虾平均体重 W为实验期间每只虾的平均摄食量
蜕皮率统计方法：由于在实验中有虾自然死亡，只计算最后存活的虾的蜕皮数，不统计已死亡的虾的蜕皮数。
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3．形态观察：每组20只，取样时每个处理随机取3只。其他方法同前。常规组织切片技术、电镜技术；关键是XO-SG，Y-器官的组织切片及电镜技术。
4．酶的测定
动物分组同方法3 。
细胞色素氧化酶(Cytochrome oxdase) 取虾肝胰腺0.5-1.0g，在0.2mol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=7.4)中冰浴匀浆，将匀浆液于4℃条件下，先1000g离心10min,取上清液再15000g离心20min，取后者的沉淀部分重新悬浮于磷酸缓冲液中，即得粗酶液，然后按Smith方法(1954)测定。同时，用双缩脲测定蛋白质含量(蔡武城等，1982),计算细胞色素氧化酶的比活性。
碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AKP) AKP活性采用试剂盒，按照磷酸苯二钠法测定。具体操作按试剂盒中的说明书进行。AKP活性定义为100ml血清在37℃与底物作用15min或60min，产生1mg酚为一个金氏单位。
血蓝蛋白(ceruloplasmin CP) CP催化联大茴香胺转变成淡黄棕色产物，加终正剂后形成紫红色溶液在540nm测定吸光度，根据产物的吸光系数可计算酶的活力。采用试剂盒测定。CP活力定义为反应液在最适pH及最适浓度下，每分钟催化转变反应体系中1μmol底物的酶量为一个国际单位。
ATPase酶活性测定(刘存歧，2001，水产学报) 取冷冻幼虾,用重蒸水冲洗三次 ,吸水纸吸干 ,加入适量预冷的缓冲液 (250ｍＭ蔗糖 ,5Mmedta,50ｍＭ咪唑 乙酸缓冲液 ,ｐＨ =7. 4),冰浴中用超声波匀浆机匀浆。取 0 . 2 5ｍＬ匀浆液与 0 . 55ｍＬ缓冲液(含ＭｎＣｌ2 6ｍＭ ,ＮａＣｌ 1 0 0ｍＭ ,ＫＣｌ 1 0ｍＭ ,Ｔｒｉｓ 乙酸缓冲液 2 5ｍＭ ,ｐＨ =7. 4)混合在 1 . 5ｍＬ的离心管中 ,2 5℃水浴 2 0ｍｉｎ ,加入 0 . 55ｍＬ的 1 0ｍＭＮａ2 ＡＴＰ反应 1 0ｍｉｎ ,再加入 0 . 1 5ｍＬ的 1 . 2ｍＭＴＣＡ终止反应。0℃离心 5ｍｉｎ(1 2 0 0 0ｒ·ｍｉｎ- 1 )。取上清液 0 . 5ｍＬ用钼蓝法测定无机磷 ,在 660ｎｍ波长下用Ｇ751分光光度计测定吸光值 ,ＡＴＰａｓｅ活力用毫微摩尔无机磷 /毫克蛋白 /小时 [ｎｍｏｌＰｉ·(ｍｇ·ｈ) ]表示。空白仅将匀浆液换为重蒸水即可 ,重复上述步骤。每个样品做两个平行。Ｆｏｌｉｎ酚法测粗酶液的蛋白浓度。
ATPase也可采用试剂盒法测定
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5．激素的测定
血淋巴中的20-羟基蜕皮酮(HE)：采用放射免疫盒测定(姜仁良,1992；曹梅讯等，
1980)血淋巴中pH值的测定
6．铜、钙含量的测定(以 HPLC型原子吸收分光光度计测定)
样品或饵料中铜离子含量的测定(刘发义,1990)：在105℃，6h烘干至恒重，研碎后，称取适量粉末，用浓和浓硫酸湿法消化，待测。
水中铜离子浓度的测定(袁维佳，上海师范大学学报，2000，29卷第3期)：由于原子吸收分光光度计有一定的检测范围 ,而水样品中的有些重金属含量微乎其微 ,不易被分光光度计测出 ,所以采集的水样要经过浓缩后再测 .各水样取 1 0 0 m L置于烧杯中在电炉上加热 ,使其沸腾约 2 0 min,将大部分水蒸发掉 .将剩余水样转移到 1 0 m L的容量瓶中 ,加 2 m L HNO3 消化后定容 ,待测。
六．实验器材：
1. 微量吸液器； 2. PAGE电泳仪（进口） 3. 电子天平；
4. 常规实验工具(镊子、解剖器械等)； 5. PCR仪；
6. 高效液相色谱分析仪； 7. 琼脂糖凝胶电泳设备； 8. 凝胶成像检测分析仪； 9. 数据分析软件；
