基因组学知识点整理

Ac/Ds系统是玉米转座子系统之一。Ac是自主控制因子（autonomous element），或称激活因子，长4563bp，含有一个转座酶基因和一段与转座酶的近末端重复区域邻接的、短的不完整的反向重复序列。Ac缺失后能形成不同形式的Ds。Ds-a和Ac相似，只缺失了部分转座酶基因。这点可解释Ds自身不能发生转座的原因。Ds-b的缺失片段较长，仅保留了转座酶基因的一个小片段。Ds-c仅剩有Ac因子中反向重复序列和与转座酶结合的近末端重复区域。这些区域和片段都是Ds-c在Ac指导下转座所必须的靶位点。Ac能自主转座，并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂，它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds控制结构基因的表达，有剂量效应，当Ac剂量增加时，相关的遗传效应延迟发生。

Ds是非自主因子（nonautonomous element），又称解离因子，是与Ac属于同一家族的控制因子，Ds是由Ac因子中间序列的缺失而形成的，从而失去转座酶功能。当Ac因子存在时，能活化Ds，使其在基因组内转座或插入结构基因之内，导致基因失活或改变结构基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。玉米Ds的存在能抑制邻近基因的表达。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总是转移到邻近的位置，当插入新靶位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由此可引起显性基因丢失，隐性基因表达。

（小结）Ac是自主控制因子，Ds是非自主因子，Ac因子能自主转座并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂，它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds因子控制结构基因表达。Ac因子中间缺失后能形成不同形式的Ds因子，无转座酶功能。Ac因子能活化Ds因子，使其在基因组内转座或插入结构基因内导致基因失活或改变基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。Ds因子必须由Ac提供转座酶才能转座，Ds因子或多或少缺失Ac因子中的部分片段。所有的Ds因子要实现转座，必须由一对IR和与其比邻的一段短的可被Ac转座酶识别的序列。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总是转移到邻近的位置当插入新靶位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由此可引起显性基因丢失，隐性基因表达。

非编码RNA（siRNA和miRNA的产生过程、相同点、不同点）

小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。本文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。 siRNA介绍

RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后，

Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。siRNA 的3´-末端2-nt 的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。例如，在基因操作较困难的神经元中，也有成功进行RNAi的报道。Krichevsky等将化学合成的21nt siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达，获得RNA干扰的成功。RNAi能在极低浓度（nmol范围）siRNA存在下显示出特殊有效性。 miRNA介绍

miRNA的研究起始于时序小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。

miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因，对组织的发育起重要作用。

在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA，需要符合以下条件：a）表达需要用Northern-blot来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a（表达）和b（结构）两条标准；或者a（表达）和c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a（表达）和前体RNA分子结构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。

寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法——TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。

RISC介绍

RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。它涉及到小RNA的生产器（Dicer）；小RNA螺旋结构及相应的RLC组装；解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。通过对链两端的热力学稳定性分析，可以将siRNA分为两大类：对称性siRNAs和非对称性siRNAs。对称性siRNAs有着相同稳定性的末端；从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarz et al., 2003)。与之不同的是，非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。因为稳定性较差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上，这个过程我们称之为“RISCs的非对称性组装(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白质使得RISCs有着不同的功能，这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。根据AGO蛋白质的不同，我们将RISCs分成两种：切割型RISC和非切割型RISC。但具体到一个RISC是否切割一个目标mRNA分子，情况就更为复杂些，一般的以下五个方面决定(Tang, 2005)：a）必须是切割型RISC；b）小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平；c）特定生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况（就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地位，是切割还是抑制）；d）小RNA分子的来源背景；e）目标mRNA的特性（数量，更新速率，结构，翻译能力）。

siRNA的生成及作用机制

dsRNA 引起的RNAi 大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增: 1、启动阶段

研究发现体内dsRNA 除外源性导入外，可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列或其他未知途径。研究证实dsRNA 在体内通过21～23 个核苷酸(nt) 片段即小干扰RNA ( siRNA) 发挥其抑制作用。RNase Ⅲ是为数不多的对长dsRNA 显示特异性的核酸酶，依据区域结构可将其分为3 个类型，其中第3 类以果蝇的CG4792 和线虫的K12H4. 8 为代表，

二者在RNA 干扰过程中可以将dsRNA 加工成siRNA，现在称此酶为Dicer 酶。人类Dicer 酶是一个接近普通RNase Ⅲ的蛋白，能够结合并剪切不同的dsRNA。其结构主要包括:N 端螺旋酶区、PAZ区、C 端RNase Ⅲ区(由dsRNA 结合区和串联核酸酶Ⅲ区组成) 以及ATP 结合区和DECH 盒。另外，在其他诸如小鼠等生物中也发现类似的Dicer 酶。Dicer 酶在剪切长dsRNA 为siRNA 过程中起了关键性作用。在线虫及其他生物中发现了lin24 和let27，这是2 个单链RNA 分子，其突变失活可影响发育，被称为stRNA (small temporal RNA) 。二者是特异性蛋白编码基因的负性调节因子，可在翻译水平上调节基因表达。成熟stRNA可与mRNA的3’端非编码区结合而阻遏其翻译，并不引起mRNA 降解。 2、效应阶段

Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成21～23nt 的siRNA， 使之能有效降解同源mRNA， 而当siRNA 浓度增加到一定阈值时，mRNA 降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi 所需蛋白因子。进一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一种复合物，被称为RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一种核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，实验证实这些成分是RISC 的一部分且为RNAi 所必需。在剪切过程中siRNA 的结构起了重要作用，具有典型结构的siRNA 较平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3′端外悬的第2 个核苷酸影响siRNA 对靶mRNA 的剪切作用。另外，siRNA 对

靶mRNA 剪切具有精确的序列特异性。 3、倍增阶段

以往实验发现仅需少量siRNA 即可引起强烈同源基因表达抑制，因此众多学者推测在RNAi 过程中存在倍增放大机制。有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的21～23nt 片段可能会作为新的siRNA 而继续参与RNAi 过程， 从而使干扰作用放大。这种扩增机制只是一种推测，是否存在尚需进一步的实验研究确定。RNAi 的系统性作用也是其引起人们关注的重要原因，但机制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系等细胞中成功进行了RNAi 实验，并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。Krichevsky 等用合成的siRNA 导入有丝后期的原代神经元中，有效抑制了其内源性基因表达，使应用RNAi 技术研究神经发育及功能成为可能;不久前Song 等在小鼠体内进行RNAi 实验，有效抑制了Fas21 基因表达，从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，为进行RNAi 的动物实验奠定了实验基础。随着RNAi 作用机制的进一步明确、应用技术的完善成熟，RNAi 技术必将为人类研究基因功能，以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武器。

RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，但这并不是说反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。因为降解首先在相对于siRNA来说的位置发生，所以这些的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应，相对而言，3´末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。 miRNA的生成及作用机制

与小分子siRNAs相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些，首先pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存在差别，成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。而在siRNA通路中，单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA，而siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。

一般来说，一种miRNA它在mRNA上的识别位点有多个，而这种多个识别位点对于miRNA发挥其转录后抑制作用是必要的。3’非编码区也是翻译的一个重要组成部分。一个转录本的总体结构由5'非编码区(5'Untranslated Region，5'UTR)，编码区（Open Reading Frame，ORF）和3'非编码区（3' Untranslated Region，3'UTR）组成。现已了解3'UTR具转录本特异性，它在mRNA转录后修饰、细胞内定位及转运、维持mRNA稳定性及保证翻译的效率方面都具重要的功能。3'UTR是发生3'末端加工的区域，包含各种顺式(cis-)作用元件，能够和特定的加工复合物互作以mRNA的3'末端加工。对哺乳动物的研究表明，真核生物中3'末端加工涉及3'UTR内某个位点的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾[Poly(A+)]两个关键过程。应用缺失实验和序列分析已确认了哺乳动物mRNA的3'UTR包含了核心顺式作用元件。这类元件与加工复合物的相互作用是3'末端形成的核心机制，包括三部分：Poly(A+)位点，也可称为剪切位点(cleavage site， CS)，保守序列为YA (Y代表T 或C)的二聚核苷酸，这种保守序列的单碱基比例为A > T > C > G；Poly（A+）位点上游（5'端）10-30 nt 处存在着保守的Poly(A+)定位信号序列(以AATAAA为主)。Poly（A+）位点下游（3'端）存在着稳定3'末端加工复合物作用的保守性稍差的T/GT丰富序列，称为下游作用元件。

miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3´端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。

对于miRNAs的研究已经成为目前的一大热点，而种种迹象表明miRNAs可能是一类与肿瘤发生有关的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a与CLL有关，miRNA-142则与侵袭性的B细胞性白血病有关。研究发现，一些miRNAs能够在肿瘤形成中发挥作用，可以作为肿瘤抑制基因；另外一些miRNAs则是作为癌基因存在。植物miRNA从2002年起才有报道，编码植物miRNAs的基因明显不同于其他生物：植物编码miRNA基因的转录产物可能更大，植物的miRNA与互补结构的错配一般也少于动物，在进化上表现地更为保守。但和动物miRNA一样，miRNA的转录产物也是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切割后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。科学家们已发现miRNA在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发生，动物胚胎及组织发育等。例如，在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育过程。Brennecke等人利用电脑寻找靶标基因，证实了miRNA不完全结合3´UTR中存在细胞死亡诱导基因，这提示说明miRNA对生长发育进行更为重要的作用。尽管现在研究者们对

于miRNAs的认识越来越深刻，仍然有很多的猜想需要证实，比如对miRNAs的潜在的生物学效应的猜测；miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的作用可能和转录因子一样重要；miRNAs可能代表一个新层次上的基因表达模式，等等。所以说，大多数miRNAs的功能仍然是个谜，有待于研究者们更深入的研究。

siRNA和miRNA的相同点和不同点

相同点：

1、二者的长度都约在22nt左右；

2、二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点； 3、二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在；

4、二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠； 5、miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前提形成。 不同点：

1、根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。

2、结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。

3、Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre--miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

4、在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3’--UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5、在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后。 6、miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

基因陷阱（Gene Trap）

1 . 基因陷阱的原理 目前已发展了三种不同的陷阱系统 ———增强子陷阱,启动子陷阱和基因陷阱 。它们之间最大的不同体现在报道基因重组体的组成和插入位置上。基因陷阱是这三种方法的统称。 1 . 1 增强子陷阱(enhancer t rap) 将某报道基因与一个精巧的启动子相连,组成一增强子陷阱重组体(见图1B) ,它不会自主起始转录,而需由被插入的细胞基因组中的增强子帮助才可转录。若报道基因最终表达,则可推知插入位点附近有增强子,或有基因,即实现了以该增强子陷阱重组体发现增强子的目的。

1 . 2 启动子陷阱(p ro moter t rap) 通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上(见图 ①C) ,一旦发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达,则可知该报道基因附近有启动子,从而起到了以之为诱饵,发现启动子的目的,这就是启动子陷阱。

1 . 3 基因陷阱(gene t rap) 基因陷阱重组体由报道基因和接受体剪接部位(splice

acceptor , SA)组成(接受体剪接部位在报道基因上游) ,该重组体需要插入到细胞基因组的内含子中随着基因转录和表达(见图1D) ,故如能检测到融合转录物或融合蛋白,则证明插入位置附近有基因存在[ 2 ]。

启动子陷阱和基因陷阱都有位置,前者需插入到外显子,后者则需插入到内含子,增强子陷阱却没有此位置;由于增强子与基因的位置可近可远,故增强子陷阱不易定位基因;此外,对启动子陷阱和基因陷阱而言,插入可能导致基因失活。下面以带SA的基因陷阱(即第三种基因陷阱)的一个成功例子具体阐明这一系统的工作原理。1998年Tate等以β2半乳糖苷酶2新霉素磷酸转移酶为报道基因,和上游的接受体剪接部位SA构成重组体, 只有以正确的方向整合到内含子的表达基因才有可能被剪接成基因转录物或表达为融合蛋白,利用此基因陷阱“钓”出了一小批新的染色体蛋白和核蛋白[ 3 ]。 2 . 基因陷阱的特点 基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因,细胞基因本身的转录和表达不受影响,所以可检测功能上多余的基因,也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因,或低水平表达的重要基因,而以前的功能基因组学的方法对这些基因都是无法确定的。 基因陷阱的不足主要表现在以下几个方面:

(1) 表达基因的确定较困难且耗时长 ———如何克隆和筛选融合转录物或融合蛋白是一件很费时费力的事。通常根据所插入的报道基因的DNA序列为引物,用PCR技术获取两侧序列,再与ES T数据库比较和确定基因功能。最近出现一些很好的解决方法,如在RACE的微透析和固相测序中采用自动化和荧光测序,可缩短时间;或只测一小段DNA序列即与ES T数据库已有序列进行比较,若已有人研究过,则不用继续,若从没研究过,则应得到目的基因全长并分析其功能。

(2) 突变的细胞的表型不明显 ———主要原因是被捕获的基因不一定有很明显的表达方式,以及突变的ES细胞克隆不一定有明显的表型。目前的解决方法是进行体外预先筛选我们需要的融合基因株系。

(3) 报道基因表型可能会丧失 ———若报道基因没按预期加以整合,或报道基因被剪接时整个被切除,都可能使报道基因表型丧失而无从着手。

(4) 目前使用的基因陷阱系统对细胞的伤害大 毕竟基因陷阱是插入了一段外源DNA ,所以是一种剧烈的方法,会有致死效应(美国加州大学Berkeley分校的实验室的细胞或胚胎致死频率是1/ 3)[ 4 ]。在一些情况下应采用柔和一些的方法,如进行重组体的置换而不是插入,用点突变,选择性地采用表型突变[ 5 ]。 3 . 基因陷阱的应用 基因陷阱的应用主要集中在医疗和制药上,而目前小鼠是探讨人类生理过程最好的模型,因此许多应用性的工作都以小鼠作为研究对象。一般在小鼠中不使用增强子陷阱,其基因组很大但基因频率很低,故很难定位增强子;报道基因一般是lac2Z ,它的上游有一个或多个受体剪接部位,由逆转录病毒引入全能胚胎干细胞,再移入小鼠种系中。1988年就已有人在小鼠细胞中使用基因陷阱[ 6 ]。最近美国国立卫生院(N IH)的科研人员报道以小鼠为材料,利用H IV21慢病毒来研究哺乳动物的细胞分化和发现新的基因,而慢病毒作为基因陷阱载体,是因为他们可随机插入动物细胞的基因组并可长期表达[ 7 ]。法国和日本的科学家利用乙肝病毒(HBV)的DNA帮助基因陷阱的插入整合,来确定未知的肝癌相关基因。这说明可通过研究病毒基因的整合位点来确定人类疾病相关基因,同时证明这些由HBV构成的基因陷阱附近的基因对细胞增殖和生长有重要作用[8 ]。近些年来,许多著名的大学和研究所已建立自己的基因陷阱实验室,如英国牛津大学,美国冷泉港实验室等。此外,许多生物制药公司和研究团体都看好基因陷阱在生物医疗和制药方面的DNA分子标记可对特定淋巴细胞的发生及迁移进行跟踪,从而为人们进一步探索淋巴细胞的成熟、归巢等提供了良好的研究平台。

4 .展望

尽管目前斑马鱼作为免疫学模式生物还只是刚刚起步,但由于其具有发育生物学研究方法成熟、进化地位特殊、遗传突变筛选简便等特点,在未来的研究,特别是免疫系统的发生、发育及特异性免疫系统进化起源等研究领域中必将发挥日趋重要的作用。

平衡化cDNA文库

平衡化cDNA文库三种平衡化理论 （PDF里的英文翻译） 饱和杂交到基因组DNA

基因频率在DNA水平上是相等的 基于关联动力学

罕见的物种二次动力学cDNA的再次退火将退火较慢 寡核苷酸指纹

基于一系列短的寡聚核苷酸探针对于高密度序列的单个的cDNA克隆经特定杂交缠身特征型的cDNA序列即为指纹

分子标记显性和共显性问题

有关分子标记共显性

分子标记中，显性和共显性，指allele而言，即指所扩增的PCR产物(DNA片断)。象RAPD、ISSR等显性标记，PCR产物无法确切确定，因而无法区分杂合体（heterozygosity），只能按有带无带进行分析，记录为0/1；而SSR等共显性标记，则能区分杂合体，即二倍体及多倍体染色体DNA上的不同变异都能显现出来，而且不仅可采用0/1记录也可按扩增产物的长度（bp）进行记录和分析，是一种能区分杂合体的共显性标记，即如果同源染色体上相同的locus上，存在插入、缺失等变异，即便是单个碱基对上的差异也能同时显示并加以分辨。所以，共显性标记，在揭示遗传多样性方面要比显性标记具有更大的优势。更为重要的是，SSR引物是以外显子保守序列为引物结合点，即以已知DNA序列为基础所开发的引物，在基因组上具有特定的位置，所以在QTL等分析上，应用极为广泛。 共显性：说白了就是可以分辨出纯和的跟杂合的

这个有图示比较好理解。

首先, RAPD是随机引物，(可以理解只有正向引物，没有反向引物。)因此，它扩增出来的为引物结合位点到终点的长度。当然一条练上会有很多该引物结合位点，也就出现了很多片段。对于一个特定位点，我们可以理解只有一条正练可被扩增。因此，在该练上只有两种情况，有和没有。

对于SSR，有一对(正向引物和反向引物)。对于一个特定位点，两条练都可被扩增，因此...

T - D NA导入植物基因组的分子机理

农杆菌介导的T - DNA的转移和整合是细菌与植物细胞相互作用发生生物学效应的过程,兼具原核生物中的细菌接合转移及真核细胞加工修饰的特点。其整个过程大致包括:(1)农杆菌对受体的识别与附着; (2)农杆菌对特异的植物信号分子的感应;(3) v i r G介导的信号传导及

毒性基因的活化;(4)毒性蛋白作用产生T - DNA单链; (5)毒性蛋白转移复合体的形成及T - DNA和毒性蛋白进入宿主胞质; (6)成熟T - DNA复合体的形成; (7) T -DNA复合体在植物及细菌作用下被摄入细胞核;(8) T - DNA整合进入植物基因组。 2 . 1 农杆菌对受体的识别与附着

单个农杆菌以极性方式通过细胞表面的乙酰化酸性荚膜多糖介导附着在植物细胞表面(此过程称为接触)[ 9 ],受伤的植物组织分泌一系列的酚类、糖类、氨基酸类等趋化性物质[ 10 ]吸引农杆菌向受伤组织集中。据研究,植物细胞表面的农杆菌附着位点是有限的,根癌农杆菌和发根农杆菌的附着位点不同,每个植物细胞可以同时附着多种不同的农杆菌菌株,但只能被1个或少数几个菌株所转化。且只有在创伤部位生存了8～16 h之后的菌株才能诱发肿瘤[ 11 ],这段时间称为细胞调节期。在调节期内,农杆菌会产生大量纤维素和一些糖类化合物将自身束缚在植物细胞壁表面并将细胞包裹形成一个囊状结构(此过程称为成囊[ 12 ]) 。在农杆菌识别及附着过程中,有许多基因和蛋白质的参与。在农杆菌体内有一些染色体基因是农杆菌—植物互作所必需的,称为染色体毒性基因(Chro moso mal virulence ,chv) 。已发现10个这样的基因, 它们是chvA,chvB, pscA (ex oC) , chvD, chv E, chv G, chv I,acv以及at t R和cel。在农杆菌附着过程中,其染色体上的at t R, ch rA, chvB, pscA和cel 等基因所编码的蛋白质可能参与此过程[13,14]。其中at t R基因与大肠杆菌的一些膜蛋白或A TP结合蛋白基因具有同源性,但其产物尚不清楚。at t R只与细菌的附着有关,并不参与T - DNA的转移。chvA 和chvB缺失时,细菌将不能合成1 . 2 -环葡聚糖,表明其编码是与1 . 2 - 环葡聚糖合成有关的蛋白质,并推测1 . 2 - 环葡聚糖可能是农杆菌附着到植物细胞所必需的。chvB定位在细胞质膜上。chvA 和chvB 与at t R不同, 其缺失会影响细胞遗传物质的转移。chvA 和chvB缺失突变体无论用共培养还是真空渗入法都不能转化拟南芥[15]。pscA 基因可能编码磷酸葡糖异构酶,与胞外多糖合成有关。ChvD蛋白含有保守A TP/ GTP结合的区域,其功能尚不清楚。Chv G、chv I蛋白可能对农杆菌在植物伤口组织酸性环境下的存活有关。ceL 是与纤维素合成有关的基因,可能参与附着过程中细菌表面的成囊过程。 2 . 2 农杆菌对特异的植物信号分子的感应

最近的研究资料证实,额外的植物细胞表面分子可能对农杆菌的结合起重要作用。例如,对2种拟南芥生态型B1 - 1和Petergof ,以及2个WS生态型的T - DNA插入突变型rat1和rat3(Resistant to Agrobacterium t ransformatio n)的研究表明:农杆

菌不能结合到它的根外植体上[ 16 ,17 ]。虽然在B1 -1和Petergof 中影响农杆菌结合的基因还不得而知,但rat1和rat3突变已经知道是它们分别影响了一种为arabinogalactan的蛋白(A GP)和一种细胞壁蛋白。然而,虽然rat1 和rat2、B1 - T和Petergof对农杆菌感染属难以转化物种(recalcit rantspecies) ,但它们的雌配子仍然保持可转化性[ 18 ]。这一结果表明,农杆菌不同植物组织的附着与植物细胞表面不同蛋白有关。植物渗出物对农杆菌毒性基因的转录激活及农杆菌的附着是必需的。特别是从植物伤口渗出的单糖及小的酚类化合物可被农杆菌的“双组分”(two2co mpo nent)信号传导系统所识别。象乙酰丁香酮(Acetosyringo ne ,As) 、α- 羟基乙酰丁香酮等酚类化合物与植物中合成次生代谢产物(如木质素、黄酮类物质等)的苯丙烷途径的产物非常类似。这些酚类小分子化合物被称为信号分子,能够诱导Ti质粒上的毒性基因(v i r)的表达。

2 . 3 v i r G介导的信号传导及v i r 区基因的表达(v i r基因活化)

v i r区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后,首先是virA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白(virA) 。按照细胞感受刺激并对此作出反应的“双组分系统”学说,virA 可能是一种整合在膜上的传感蛋白。virA直接与植物渗出物相互作用[ 19 ]。当酚类物质(如AS)与感应位点结合后,会使整个virA蛋白构想发生变化,其C端活化。C端有激酶的功能,使蛋白质上的组氨酸残基发生自磷酸化作用,从而激活virA蛋白。被激活的virA蛋白可以转移其磷酸基因

至vir G蛋白。作为一种转录因子活化v i r 启动子启动v i r 基因表达。因此, vir G在此过程中起反应调节器的作用。chv E可大大增强v i r基因被AS诱导的效果,其产物chv E可结合一些单糖,也可直接与v i rA 的周质区相互作用,以加强AS对vir基因的诱导。除此之外, v i r G蛋白也可能参与此过程。一种诱导v i r基因表达的酚类化合物阿魏酸(Ferulic acid)对vir H2 突变体的作用比野生型更有效,利用质谱等方法发现野生型菌株的上清液中含有大量阿魏酸的去甲基化合物咖啡酸(Caffeic acid) 。因而vir H2 蛋白可能起到负作 用[ 20 ]。

2 . 4 毒性蛋白作用产生T - DNA单链(T - DNA加工)

v i rC、v i rD 和v i rD2 参与T - DNA单链的形成。v i rD1和v i rD2是v i rD基因编码的2个产物,它们相互作用并具有单链或特异位点核酸内切酶功能。virD1 蛋白是一种拓扑异构酶,可将超螺旋DNA转变成松驰型DNA ,并起到辅助virD2 作用。virD1识别并结合到Ti质粒- 25bp正向重复序列(T - DNA边界)上促进virD2 的酶解作用。体外纯化的重组virD2 可单独起作用切割单链的T -DNA ,但无论在体内还是体外,切割双链的T -DNA必须virD1 和virD2共同作用。virD2直接参与T - DNA的形成和加工,起内切酶作用,在T -DNA右边界处切开,随后virD2 通过Tyr29与切断的T - DNA 5′末端共价连接,避免核酸外切酶降解T - 链。此过程需DNA解旋酸参与, virD2- T -DNA释放需复制酶作用,以未切断的顶链为模板,从右向左复制合成新的T - DNA。当复制到左边时, T - DNA 释放[ 21 ]。在Ti质粒的T - DNA区留下的底链空缺随后被细菌的DNA合成酶及其相关机制进行修复, Ti 质粒复原。释放的T - DNA在virD2连接下形成单链的DNA/蛋白质复合体———未成熟的T - 复合体(Immat ure T - co mplex) 。virD2C -末端保证切割反应的准确性和有效性,而virD2整体可能作为引导子引导T - DNA链从细菌转移到植物细胞。virC(章鱼碱Ti质粒含virC1 和virC2)蛋白结合到T - DNA右边界的驱动子序列上,促进virD2的酶解剪切作用,提高转移效率。

2 . 5 毒性蛋白转移复合体的形成及T - DNA和毒性蛋白进入宿主细胞质(T - DNA转移)

vir E作为一种DNA结合蛋白,与单链T -DNA有很高的亲合力,能与任何单链DNA序列结合。vir E2突变体的致病性显著降低,由乙酰丁香酮诱导的农杆菌细胞中vir E2 蛋白大量积累[ 22 ],因而vir E2在T - DNA转移过程中可能起着重要作用。有观点认为T - DNA链形成后使全身被vir E2 蛋白包裹形成一种半刚性中空圆柱形的丝状螺旋结构的T -复合体[ 23 ]。T -复合体这种结构有利于保护T- DNA链免受细胞中核酸酶的降解[ 24 ] ,并促进其进入宿主细胞核中。vir E能够防止核酸外切酶降解T -链,而且vir E2的C -末端含有2个核定位信号(Nuclear - localizatio n Signal ,NL S)可以协助T -复合物到植物细胞核的运输。但T链形成后的转运形式目前还不清楚,vir E2的结合及作用位点也还存在争议。T - DNA的转移及vir E2 的结合可能发生在细菌细胞中[ 25 ],也可能发生在宿主细胞质中,即T - DNA转移与vir E2 的转移,是2个相对的过程,vir E2 可能是在T - DNA转化过程中由细菌产生后不与T - DNA链结合形成复合体,而是单独地转运至植物细胞内发生作用[ 25 ,26 ]。vir E2 还可能与另外一种毒性蛋白vir E1 结合成复合体形式转移到宿主细胞中。vir E1是一种特异的陪伴蛋白(分子伴侣) ,它可以帮助vir E2 以合适的形态运输到植物细胞。vir E1 能防止vir E2 与T - DNA链结合[ 27 ],当复合体转移到细胞质后,vir E2和vir E1才分离开。2 . 6 成熟T -复合物的形成及其核输入当T - DNA进入植物细胞质成为成熟的T -复合物后,细菌致病蛋白vir E2 和virD2 与植物蛋白相互作用,将T - DNA复合物转运至细胞核。virD2和vir E2 在T -复合物和输入中的作用可以通过以下的实验得到证实。随带缺少核定位信号(NL S)的virD2突变体的农杆菌株,其肿瘤发生和T - DNA的表达受到抑制。此外,也可被体外组装的vir E2-ssDNA复合物(而不仅仅是ssDNA)注入到活的植物细胞[ 28 ]的这种核输出所证实[ 29 ,30 ]。在宿主植物细胞中,virD2 和vi E2 可能与细胞内因子相互作用介导T -复合物的核输入并整合到宿主基因组。通过酵母双杂交系统已鉴定出环亲合素(Cyclop hilin、2C丝氨酸/ 苏氨酸蛋白磷酸

酶(PP2C) 、输入蛋白α(Importin -α,如At kapα)等几种与virD2和vir E2作用的植物蛋白。利用功能遗传分析及共聚焦显微镜研究表明:

V IP1在酵母和哺乳动物细胞中能促成vir E2的核输入[ 31 ]。因为V IP1是含有保守的亮氨酸锌结构域的蛋白质,与已知的动物或酵母蛋白质没有明显的同源性,表明它是一种与植物特异的vir E2 的核输入有关的细胞因子。V IP1如何促进vir E2的核输入的详细机制还不了解,但是,由于V IP1 本身定位在动物、酵母和植物细胞中的核中,它结合到vir E2 上并转运到核中。在此过程中,V IP1 可能与细胞的核蛋白- 如At kA Pα相互作用,促进vir E2 的核输入。V IP1 在T -复合物的核输入中的作用与所观察的结果是一致的,即V IP1其本身不能与ssDNA联系,但能与vir E相互作用,而vir E与ssDNA相结合,因此在体外形成一种V IP1 - vir E2 - ssDNA的三级复合体形式。最近, Tzfira[ 32 ,33 ]等证实V IP1 在转基因烟草植株中的过量表达能明显提高农杆菌介导转化的效率。除At kA Pα和V IP1外,在其他系统中的核输入中要求一种小GTP酶- GTPase Ran[ 34 ,35 ],它很可能参与T -复合物的核输入。2 . 7 T - DNA整合到植物基因组 T - DNA整合进宿主细胞基因组,是转化过程中最重要也最关键的步骤。虽然已知T - DNA在宿主细胞核中是转变成双链DNA的,但T - DNA是以双链还是单链分子的形式整合还存在争论。有趣的是大多数侵入的T - DNA分子并不能整合到宿主基因组中。然而, T - DNA 的整合效率要远远高于通过非农杆菌介导如基因等转化方法的整合效率。这可能与T -复合物白组分virD2 和vir E2的活性有关。virD2 和vir E与宿主细胞核的输入及DNA的修复机制有关,并促进T - DNA的核输入及整合。virD2在整合过程中具有双重作用:即确保整合的忠实性[ 35 ,36 ]及有效性[ 37 ]。然而,virD2 并不是一种Bo na fide连接酶,表明在T - DNA整合过程中有植物DNA连接酶的参与。而且,在整合前或整合期间应该存在将T链转换成双链T - DNA分子的宿主细胞DNA聚合酶。除DNA连接酶和聚合酶外,细胞中其他的因子也参与整合过程。例如,可能存在某些植物蛋白,这些蛋白指导T - DNA到达特定整合位点,并通过松驰染色质结构和在宿主DNA基因上形成缺刻和/ 或缺口以利于T - DNA的整合。如一种可能的宿主蛋白质是V IP2,这是一种与vir E2 结合的拟南芥蛋白[ 38 ],此蛋白与果蝇Rga蛋白同源,能介导染色质蛋白和转录复合物间的相互作用[ 39 ]。与V IP1不同的是,V IP2 不能介导vir E2 进入酵母细胞核中。然而,V IP2 和V IP1 在酵母双杂交系统中能相互作用[ 40 ]。在未感染的细胞 中,V IP1和V IP2可能直接或通过其他转录复合物组分与染色体DNA共同作用参与转录。因此,V IP1 ,V IP2或vir E2可能以一种多蛋白复合体的形式行使某些功能。这种复合体表现双重功能:它首先促使vir E2对核的靶定,然后介导vir E2 及T链在核内转移到染色体的特定区域,在这个区域宿主DNA更多暴露,因此,更适合T - DNA的整合。植物细胞中一些特定的蛋白质也参与T - DNA的整合,直到目前为止,已从拟南芥中筛选到100多个rat(resistant to agrobacterines t ransformatio n)突变体。在这些突变体中,有1个rat5的突变体在其组蛋白H2A - 1(H TA1)基因的3′非翻译区包括一个T - DNA插入[ 19 ]。rat5突变植株能瞬时但不能稳定被农杆菌转化,表明转化阻止于T - DNA整合这一步(瞬时表达时T - DNA分子不必整合到植物基因组中)[ 30 ,37 ]。rat5突变植株中H TA1基因的野生型拷贝的过量表达能够恢复转化效率。更重要的是,在野生型拟南芥植株中H TA1 基因的过量表达显著增加农杆菌介导的根转化的敏感性[ 19 ]。但通过“攒花”的方法,仅稍微增加转化频率,表明组蛋白H2A的表达并因此导致的T - DNA整合可能被在靶细胞的转化中。通过伤害、植物激素处理或农杆菌感染引起H TA1 表达模式的改变能导致转化敏感性模式某种程度的改变。这表明, H TA1 的表达可以作为一种分子“标记”,预测细胞最易于农杆菌感染的情况。有关H2A影响稳定转化的确切机制还不清楚,它可能在T - DNA整合位点特化染色质的构象。

cDNA文库合成的三种方法及如何获得全长

cDNA合成是cDNA文库构建的第一步。在克隆真核基因的编码序列时，首先要合成与mRNA互补的cDNA（copy DNA）第一链。cDNA第一链的合成由反转录酶催化，需要寡聚dT作为引物，mRNA分子作为模版。cDNA第一链合成以后，一般通过碱裂解除去mRNA，这时cDNA第一链3’端能够自然弯曲形成发夹结构作为引物，引导第二链合成。这样产生的双链DNA在一端有一个发夹结构，存在一个单链环区，需要用S1核酸酶处理成平末端，然后才能与合适的载体进行连接。该方法称为自身引导法，通过这种途径克隆的cDNA缺少mRNA分子5‘端的一端序列，这段序列有可能对蛋白质翻译十分重要。

cDNA第二链的另一种合成方法是用RNA酶H代替氢氧化钠来分解与cDNA第一链结合的mRNA分子。RNA酶H可以在mRNA—cDNA杂交体中的mRNA链上产生切口，然后通过大肠杆菌DNA聚合酶1催化的切口平移反应合成cDNA第二链，这时mRNA片断实际上被当成了DNA合成的引物。这种替代方法仍然不能合成全长cDNA，因为编码序列5‘端的一段序列无法合成。该方法称为cDNA置换合成法，由于没有包含基因的所有外显子序列，所以通过这种途径合成的cDNA用于表达时也有可能存在严重问题。

在合成全长cDNA时，一般要利用末端转移酶给cDNA第一链3‘羟基端加上多个C碱基，然后通过碱处理和蔗糖梯度离心纯化cDNA第一链，再以寡聚dG作为引物合成cDNA第二链。如果cDNA第一链合成不完全，cDNA分子的3‘端会被mRNA分子掩盖，这时末端转移酶很难将核苷酸加到cDNA第一链的3’端上。相反，全长cDNA第一链的3‘端不会被mRNA覆盖，末端加尾十分有效。该方法称为末端加尾法，通过加尾途径能够合成全长的cDNA分子。加尾途径也可以避免使用S1核酸酶。

除了以上三种基本方法外，后来还提出了一些其他的cDNA合成途径。用生物素标记mRNA的帽子结构，以oligo dT为引物反转录合成cDNA第一链，然后用RNase Ⅰ不水解RNA-cDNA杂合链的特点去除单链，这样仅有全长RNA-cDNA杂合链含有生物素标记，而非全长杂合链由于mRNA5’端仍为单链而被切除。接着用带有抗生素蛋白的磁珠可以分离到全长cDNA。

也可以用5’端具有性酶切位点、3’端具有同聚尾的寡核苷酸片段引导合成cDNA的第一链和第二链，获得的cDNA分子用相应的酶切割后，可以定向连接到载体中。如果正向连接到载体上的启动子之后，可以用抗体探针筛选目的克隆。但对内部存在相应酶切位点的cDNA分子，酶会将它们打开，这些cDNA分子便得不到克隆。