微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化
一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤
（1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化
实验操作流程 流程叙述 操作目的、作用 步骤 点燃酒精灯 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精避免周围环境中微生物的 ↓ 灯火焰 进行 污染 1.灼烧接种将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 清除 ； 接种环并冷却 让接种环自然冷却 防止 杀死菌种 方法↓ 一： 2.沾取菌液 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上，防止塞子被污染； ↓ 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环清除 的杂菌 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 3.平板划线 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌接种到培养基表面 ↓ 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 4.转动培养将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接调整角度，准备第二区域皿约70°角 种环自然冷却 的划线 ↓ 5.灼烧并冷从第一区域划线的末端开始往第二区域划在琼脂固体培养基表面连却接种环 线，重复以上操作，在三、四、五区域划续划线的操作，将聚集的↓ 线，注意不要将最后一区的划线与 菌种逐步稀释分散到培养6.平板划线 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方基的表面 ↓ 法 7．倒置培养 减少培养基内的水分蒸倒置培养皿，放入培养箱中培养 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 1
在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 1.系列稀 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 释操作 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 接种重复步骤，直至最后一支试管 方法 二： 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s 清除涂布器上的杂菌 ↓ 把培养皿打开一条缝 2.涂布平 ↓ 板操作 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布使菌液均匀分布在培菌液，转动培养皿，涂匀 养基表面 ↓ 盖上皿盖, 放置10min 使液体被充分吸收 ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜对菌落进行初步鉴定 结果色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显观察 微镜下观察。
三.巩固检测
1．获得纯净培养物的关键是 ( )
A．在无菌环境中培养 B．接种纯种细菌
C．接种环灼烧灭菌 D．防止外来杂菌的污染
2．巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒，该消毒法就是加热到70～75 ℃、保持30 min，或加热到80 ℃、保持15 min，能杀死一般杂菌和病原菌。这与灭菌的要求相比，巴氏消毒法( ) A．不能杀灭芽孢和孢子 B．只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌 C．能杀灭各种细菌，包括芽孢 D．能杀灭各种真菌，包括孢子
3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是 （ ）
A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述，正确的是（ ）
①可以获得单个的菌落 ②都需要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用来计数活菌． 杀灭哪些部分的微生物（ ）
A．接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针 C. 培养基、手、接种环 D. 接种环、手、高压锅 4.下列操作与消毒或灭菌无关的是（ ）
A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环 B. 接种前用酒精擦试双手
C. 接种在酒精灯水焰旁完成 D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板 5．制备固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
6.平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是（ ）
A. 防止菌种死亡 B．利于培养基的冷却
C．利于大肠杆菌的接种 D．防止皿盖上的冷却水倒流入培养基
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是（ ） A．为了检测温度是否最适宜 B．检查培养基是否灭菌彻底 C．为了下次接种时再使用 D．没必要放入未接种的培养基 8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是 （ ）
A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞 C．将培养皿盖全部打开后，用沾有菌液的接种环进行划线接种
D. 接种时，接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖 9. 在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数，下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作，有关叙述不正确的是（ ）
A．每次划线前都需要灼烧接种环
B．接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线 C．最后一区和第一区要保证不重叠
D．只有在图中的5区域才可以得到所需菌落
A．①② B. ③④ C.①③ D. ②④
12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述，错误的是 （ ）
A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物
C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落 D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目
13. 平板划线法：通过 在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 _____ 到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由 繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是 。
14. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别 在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度 的菌液里，聚集在一起的微生物将被分 散成单个细胞，从而能在培养基表面形成 。 15．大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109个，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题：
（1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用稀释涂布平板法进行测定。
该方法首先配置LB______________培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在___________旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用___________涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中________的数目；该数据比实际数值要______(高、低)，原因是___________________________________________ _________________________。实验完成后需要对培养基进行________处理，然后才能倒掉。 （2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配置LB_________培养基，灭菌后，将________在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养。
2
