福建农林大学学报（自然科学版） 第３９卷第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） ２０１０年７月 ７株猪圆环病毒２型福建分离株全基因组序列分析 郑敏 ，黄梅清 ，车勇良 ，邵良平 ，陈少莺 ， （１．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州３５００１３；２．福建省畜禽疫病防治工程技术 研究中心，福建福州３５００１３；３．福建农林大学动物科学学院，福建福州３５０００２） 摘要：根据已发表的猪圆环病毒２型（ＰＣＶ２）基因序列，分段设计２对ＰＣＶ２特异性引物，用ＰＣＲ方法扩增近年从福建省部 分发病猪场分离鉴定的７株ＰＣＶ２的全基因序列并进行比对分析．结果表明：７株ＰＣＶ２基因组全长１７６７ ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ上 发表的１７株ＰＣＶ２参考毒株的同源性为９４．７％～９９．５％；７株ＰＣＶ２分离株之间的全基因同源性高达９８．４％一９９．５％；７株 ＰＣｖ２ ＯＲＦ２编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性，其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达９８．９％一９９．７％和９７．９％一 ９９．６％，与参考毒株的同源性分别为９１．１％一９９．７％和８５％一１００％，存在一定的差异．可见，７株ＰＣＶ２在基因水平上差异 不显著，在地域分布上也没有明显差异． 关键词：猪圆环病毒Ⅱ型；全基因组序列；比较 中图分类号：￥８５２．６５ ９．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－５４７０（２０１０）０４－０３７０－０４ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａ／ｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｆｕｊｉａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ＺＨＥＮＧ Ｍｉｎ ’ ，ＨＵＡＮＧ Ｍｅｉ—ｑｉｎｇ ， ，ＣＨＥ Ｙｏｎｇ—ｌｉａｎｇ ＇ ，ＳＨＡＯ Ｌｉａｎｇ—ｐｉｎｇ。，ＣＨＥＮ Ｓｈａｏ—ｙｉｎｇ ，。 （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｕｊｉｎａ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉｎａ ３５００１３， Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｕｊｉａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉｎａ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏＵｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｙｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，ＦｕｊＪａｎ ３５０００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｈｓｈｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２（ＰＣＶ２）ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｎａｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｏｃａｌ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｆｕｊｉｎａ ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ＰＣＶ２ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｕｂｈｓｈｅｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ １７６７ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｏｆ ｈｔｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ １７ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｗａｓ ９８．４％一９９．５％ａｎｄ ９４．７％一 ９９．５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ＯＲＦ２ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｌｙ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｒｔｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ＯＲｂ２ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ９８．９％一９９．７％ａｎｄ ９７．９％一９９．６％ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａｎｄ ｗｅｒｅ ９１．１％－９９．７％ａｎｄ ８５％一１００％ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｅａ． ｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ＰＣＶ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｎａｄ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｒｃｏｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２；ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｃｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ 猪圆环病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｅｏｖｉｒｕｓ，ＰＣＶ）有２种基因型或血清型，即ＰＣＶ１和ＰＣＶ２．其中，ＰＣＶ２可引起 多种疾病综合症，如断奶仔猪多系统衰竭综合症（ｐｏｓｔ—ｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＭＷＳ）、猪 皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、Ａ２型先天性振颤、猪增生性和坏死性肺炎、繁殖障碍等疾病．病原学 和血清学调查证实ＰＣＶ２呈世界性分布，朗洪武等于２０００年…首次检测到ＰＭＷＳ中的ＰＣＶ的ＥＬＩＳＡ抗 体，随后大部分省市均有报道，该病给养猪业造成巨大的经济损失．据报道，ＰＣＶ２存在１７６７和１７６８ ｂｐ两 种基因型，基因组序列相对稳定，但分离自不同地区的毒株存在一定差异 Ｊ．本试验对７株近几年分离自部 分发病猪场的ＰＣｖ２进行全基因克隆与测序，并与ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的ＰＣＶ２毒株进行比较分析，比较ＰＣｖ２ 毒株之问的遗传发生关系和分子差异，明确Ｐｃｖ２福建株基因序列的变异程度，进一步补充和丰富福建省 收稿日期：２０ｏ９一ｌＯ一１２ 修回日期：２００９—１２—０９ 基金项目：福建省科技厅重大项目（２００６ＮＺ００３－２）． 作者简介：郑敏（１９８３一），女，硕士．研究方向：分子病毒学．通讯作者陈少莺（１９６２一），女，研究员，硕士．研究方向：动物病毒病防治技术 Ｅｍａｉｌ一’－；ｅｌｒｌｓｙ￣８＠１６３．ｃｏｍ． 第４期 郑敏等：７株猪圆环病毒２型福建分离株全基因组序列分析 ・３７ｌ・ ＰＣＶ２流行病学资料，旨在为今后深入研究该病的分子生物学特性以及开发有效的免疫制剂提供参考． １材料与方法 １．１病毒株 ７株ＰＣＶ２均系本项目组在福建漳州、南平、宁德等地猪场采集，ＰＭＷＳ病例病料分离鉴定后保存，编 号分别为ＦＪＭＨ０５０８、ｒｊｒＱＯＳ１ １、ＦＪＺＺ０５１２、ＦＪＧＴ０６０２、ＦＪＮＤ０５１２、ＦＪＮＰ０４１２和ＧＺ０６０４． １．２主要试剂 ． ｄＮＴＰｓ、ｒａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ酶、性内切酶ＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ￣Ｉ、克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ连接试剂盒，购 自宝生物（大连）工程有限公司；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动 物病毒室提供． １．３全基因序列扩增和测序 １．３．１ 引物设计与合成参照ＧｅｎＢａｎｋ已发表的ＰＣＶ２基因序列，分段设计合成２对引物．第１段扩增长 度１１６５ ｂｐ，引物为上游ＰＣ５（５ 一ＡＣＣ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴｒ ＣＧＧ ＣＡＧ Ｃ一３ ）、下游ＰＣ３（５ 一ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＴＡ ＧＧ－３，）．第２段扩增长度６１４ ｂｐ，引物为上游ＰＣ１（５ 一ＴＣＴ ＡＣＡ ｍ’ＣＣＡ ＧＣＡ ＧｒＩＴ ＴＧ－３ ）、下游 ＰＣ６（５ 一ＡＡＴ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴｒ Ｃ一３ ）． １．３．２核酸提取ｄＮＴＰ、０．２ 参照文献［３］的方法进行． ＬＡ Ｔａｑ酶、０．４ ＩｘＬ上下游引物、２ Ｌ ＤＮＡ模板．２对引物ＰＣＲ扩增条件均为：９５℃预变 １．３．３ ＰＣＲ反应体系２对引物均采用２０ Ｌ反应体系，含ｌ３．４ Ｌ ＤＥＰＣ、２ ｔｘＬ １０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、１．６ 性５ ｍｉｎ，９４℃变性１ ｍｉｎ、５３．５ ｏＣ复性１ ｍｉｎ、７２ ｏＣ延伸１ ａｒｉｎ，共３５个循环，最后于７２＇ｔ２延伸１０ ｍｉｎ，置４ ℃保存． １．３．４ ＰＣＲ产物克隆和酶切鉴定用Ｂｉｏｓｐｉｎ琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收ＰＣＲ产物，将回收的ＰＣＲ 产物与ｐＭＤ１８一Ｔ载体连接，再将连接物转化入ＤＨ５ａ感受态细胞．用碱裂解法提取重组质粒ＤＮＡ，对重组 质粒进行双酶切鉴定．重组质粒鉴定为阳性的送大连宝生物工程有限公司进行序列测定． １．４全基因组特性分析 用ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序将７株ＰＣＶ２全序列与ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ｌ７株ＰＣＶ２和２株ＰＣＶ１全 基因序列进行比对，分析其同源性、遗传变异情况和抗原表位等特性． ‘ ２结果与分析 ２．１ ＰＣＲ扩增 ７株ＰＣＶ２经ＰＣＲ分段扩增均能出现与预计目的片段大小一致的特异性条带，引物ＰＣ１／Ｃ６和 ＰＣ３／ＰＣ５扩增片段大小分别为６１４和１ １６５ ｂｐ． ２．２重组质粒酶切鉴定 重组质粒经Ｈｉｎｄｌｌｌ和ＢａｍＨＩ双酶切后电泳，结果与预计片段的大小一致，引物ＰＣ１／Ｃ６和ＰＣ３／ＰＣ５ 扩增片段分别为６１４和１１６５ ｂｐ． ２．３ ＰＣＶ２全序列及进化分析 测序结果经拼接后发现７株ＰＣＶ２基因组全长均为１７６７ ｂｐ，与加拿大毒株ＡＦ０２７２１７比较发现，７个 分离株均在第１０４２位上缺失了一个碱基Ｔ．７株ＰＣＶ２毒株在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号分别为ＧＵ２４７９９０ （ＦＪＭＨ０５０８）、ＧＵ２４７９８９（ＶＪＦＱ０５１１）、ＧＵ２４７９８７（ＦＪＺＺ０５１２）、ＧＵ２４７９９１（ＦＪＧＴ０６０２）、ＧＵ２４７９９２ （ＦＪＮＰ０５１２）、ＧＵ２３３８０４（ＦＪＮＰ０４１２）、ＧＵ２４７９８８（ＧＺ０６０４）．７株ＰＣＶ２之间的核苷酸同源性高达９８．４％一 ９９．５％，亲缘关系密切；７株ＰＣＶ２分离株与ｌ７株参考病毒间基因组的同源性为９４．２％一９９．７％． 遗传进化分析结果（图１）表明，７株ＰＣＶ２福建株与法国分离株在同一个分支上，亲缘关系最近，同源 性为９９％左右，在此分支中，主要以中国分离株为主．其中，ＦＪＮＰ０４１２、ＦＪＭＨ０５０８、ＧＺ０６０４、ＦＪＦＱ０５１１组成 了一个小分支．ＦＪＺＺ０５１２、ＦＪＮＤ０５１２、ＦＪＧＴ０６０２与ＤＱ２０１６４２（中国山东）、ＤＱＸ８３９２（中国福建）、ＡＦ２０１８９７ （新西兰）、ＡＹ１７１６２６（中国广东）等组成了ＰＣＶ２中的另一个小分支；ＦＪＧＴ０６０２与ＤＱ２０１６４２（中国山东） 福建农林大学学报（自然科学版） 第３９卷 Ｄ０２０１６４２ＣＨ＾＿ｓＤ２０ｏ５ ＦＪＧＴ０６０２ 亲缘关系最近，同源性为９９．７％；ＦＪＺＺ０５１２与ＱＤ１０４４２２ （中国江苏）亲缘关系最近，同源性为９９．７％；ＦＪＮＤ０５１２ 与ＡＦ２０１８９７（新西兰）亲缘关系最近，同源性为９９．７％． 表明ＰＣＶ２基因组差异可能与地域性关系不大． ２．４ ＰＣＶ２ ＯＲＦ２核苷酸及其推导的氨基酸同源性比较 ＱＤ１０４４２２ＸＳＣ啪５ ＦＪＺ￣５１２ ＡＹ５７９８９３ｚＩ２００＿ｌ ＦＪＮＰ０５１２ ＾Ｙ２９１３ｌ８ＣＨ＾ Ｈ ＡＦ２Ｏ１８９７ＮＥＷＳＬ＾Ｎ２Ｏ００ ＥＦ４５２３５０ＵＳ＾２０Ｄ７ ＡＦ０５５３９４ＦＲ Ｄ０ｌ舳３２９２ＦＪ２００５ ＡＹ１７７６２６Ｇ咖３ Ｉ）０６２９１ １９ＵＳ＾２Ｏ０７ ＦＪＭＨ０５０８ ＦＪＮＰ（）４ｌ２ ＧｚｃＩ６０２ 同源性比较结果（表１）表明，７株ＰＣＶ２福建株 ＯＲＦ２全长７０２ ｂｐ，无缺失、无插入，编码２３３个氨基酸． ７株分离株间的ＯＲＦ２核苷酸及其推导的氨基酸同源性 分别为９８．９％一９９．７％和９７．９％一９９．６％；与ｌ７株参 考株ＰＣＶ２ ＯＲＦ２核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别 为９１．１％一９９．７％和８５％一１００％．对ＯＲＦ２推导的氨 ＦＪＦＱ０５１ｌ ＡＦＯ２７２１７ＣＡＮ ＾Ｙ４２４４０ｌＡＵＳ ＡＦｌ５４６７９ＴＡｌ ＡＢｏ７２３０２Ｊ＾ＰＡＮ ＾Ｙ５１０３７５ＣＨ＾．ＨＺ ＾Ｙ５５６４７３ｃｈＢＳＤ ＾Ｙｌ８１９４６ＣＨ＾＿ＴＪ ＡＲ７５６６８２ＵＳ：Ｄ ｌＡＸ６９４３１９ＥＰ：伪３ ｌ１０ ８ ６ ４ ２ ０ 基酸序列分析发现，７株分离株的ＯＲＦ２编码的氨基酸 １１．４ 序列与１７株参考毒株相比，共有６个位点存在变异，分 别是：ＦＪＮＤ０５１２在ｌ７位上由Ｓ变为Ｎ；ＦＪＮＰ０４１２和 核酸替换率（ｘ１００） 图１ ＰＣＶ基因组全序列的进化发育树 Ｆｉｇ．Ｉ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＰＣＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｃｎｏｍｅｓ ＦＪＭＨ０５０８在３Ｏ位上由Ｖ变成Ｌ；ＦＪＦＱ０５１１在４４位上 １３１位上由Ｔ变成Ｐ． 由Ｉ变成Ｔ；７株分离株在６３位上均由Ｒ变成Ｋ；ＦＪＮＰ０４１２在７２位上由Ｍ变成Ｔ；ＦＪＧＴ０６０２和ＧＺ０６０４在 表１ ＯＲＦ２核苷酸及其推导的氨基酸同源性比较 Ｔａｂｌｅ １ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｆｏｒ ＯＲＦ２ ”右上侧为ＯＲＦ２核苷酸Ｊ司源性比较，左Ｆ侧为ＯＲＦ２推导的氨基酸同源性比较． ３讨论与结论 （１）本试验测定并分析了近年分离自福建省部分发病猪群７株ＰＣＶ２流行株的基因组差异，结果表 明：分离株均为１７６７ ｂｐ亚型，７株ＰＣＶ２之间的核苷酸同源性高达９８．４％一９９．５％，在基因水平上差异不 显著；而７株分离株与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的ＰＣＶ２参考株间的全基因同源性为９４．７％一９９．５％．遗传进化分 析结果表明，目前全球ＰＣＶ２主要分为两大支：一支以北美ＡＦ０２７２１７（加拿大）分离株为代表，另外还有 ＡＹ４２４４０１（澳大利亚）、ＡＢ０７２３０２（Ｅｔ本）、ＡＦ１５４６７（中国）分离株；另一支以欧洲分离株为代表，主要 第４期 郑敏等：７株猪圆环病毒２型福建分离株全基因组序列分析 ・３７３・ 有ＡＦ０５５３９４（法国）、ＡＦ２０１８９７（新西兰）和部分中国分离株．国外有研究认为，ＰＣＶ２的遗传变异与地域有 关 ］，但也有学者认为ＰＣＶ２分离株与地域无关 Ｊ．而在本试验的基因进化树上，很难看出基因分支与地 理位置有关，国内大部分毒株与法国、新西兰的同属一个分支，且ＦＪＮＤ０５１２与ＡＦ２０１８９７（新西兰）亲缘关 系最近；同时，我国的部分毒株与加拿大、澳大利亚、日本等国家的亲缘关系密切．由此发现不同地域的 ＰＣＶ２分离株基因序列差异性不大，我国ＰＣＶ２分离株的类型与地域之间没有明显的相关性．本试验结果 还表明，中国毒株的来源可能较为复杂，有的可能来源于欧洲，有的可能来源于美洲，这可能是由我国与欧 美等国家有频繁的种猪交流等原因造成的．然而，中国分离株之间在进化上又相对，亲缘关系较近，这 可能是因为ＰＣＶ２传人我国的时间比较久，经长期的进化而逐渐形成中国的地方株． （２）ＯＲＦ２是ＰＣＶ２基因组变异性较大的片段，编码病毒的主要结构蛋白（Ｃａｐ蛋白） ｊ，由于Ｃａｐ蛋 白与ＰＣＶ２的致病性有关，其变异可能导致新型变异毒株的出现 ．本试验测定的７株ＰＣＶ２分离株的 ＯＲＦ２长度均为７０２ ｂｐ，编码２３３个氨基酸，同源性为８５％一１００％．分析ｌ７株参考ＰＣＶ２株ＯＲＦ２推导的 氨基酸序列，其Ｎ端相对保守，主要由碱性氨基酸组成，变异大多发生在５２—９２、１２１—１５２，１８０—２３０位的 ３处高变异区．与参考毒株相比，７株分离株ＯＲＦ２编码氨基酸序列共存在６个变异位点，分别在第１７、３Ｏ、 ４４、６３、７２、１３Ｉ位上．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ 研究表明，位于ｌ２一ｌ８和３４—４ｌ位的氨基酸残基对ＰＣＶ２的ＯＲＦ２最重 要，对Ｃａｐ蛋白的核内定位起着决定性的作用．本试验中ＦＪＮＤ０５１２的第１７位由ｓ变为Ｎ，对Ｃａｐ蛋白将 产生怎样影响还有待进一步研究．此外，本试验中７株ＰＣＶ２毒株间在５９—８０和１２１—１３６位这２个与免 疫表位相关的位点均出现不同程度的变异，７株分离株在６３位上都由Ｒ变成Ｋ，ＦＪＮＰ０４１２在７２位上由Ｍ 变成Ｔ，ＦＪＧＴ０６０２和ＧＺ０６０４在１３１位上由Ｔ变成Ｐ．Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ 研究表明，ＰＣＶ２毒株间３个主要氨 基酸变异区域（５９—８０、１２１—１３６和１８０—１９１位）中有２个区域（５９—８０和１２１—１３６位）与由ＰｅｐＳｃａｎ分 析编码ＯＲＦ２的基因鉴定的２个主要免疫反应区域（６５—８７和１ １３—１４７位）相对应，这些位点暴露于免 疫压力之下，有可能会发生突变而产生新的毒株．本试验分离株中产生的这些变异位点是偶然发生还是病 毒开始新的变异，产生具有不同于其他毒株组织嗜性和致病性的新型毒株，在病毒特异性上是否会有性质 的改变等特征还有待进一步证实． （３）ＯＲＦ２基因亲水性和抗原表位分析表明，ＯＲＦ２表达的蛋白Ｎ端富含精氨酸和碱性氨基酸，其ｌ０ —４０位具有高度的亲水性；在４一ｌ４、３４—３９、６５—８７、１１３—１４７、１７７—１８０位可能存在抗原表位，ＯＲＦ２具 有很强的抗原性，这与文献［９］报道的ＯＲＦ２编码的蛋白可以被ＰＣＶ２的多抗识别相一致．抗原表位是研． 究抗原的免疫机制和表位疫苗的基础，正是出于ＯＲ．Ｆ２的特性，使其成为临床上在分子生物水平上诊断 ＰＣＶ２的理想抗原，对疫苗的研制和流行病学研究有重要意义． 参考文献 ［１］郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶仔猪多系统衰弱综合症血清抗体检测［Ｊ］．中国兽医科技，２０００，３０（３）：３—５． ［２］ＯＬＶＥＲＡ Ａ，ＣＯＲＴＥＹ Ｍ，ＳＥＧＡＬＥＳ Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｍｓ ｔｙｐｏ ２ ｇｅｎｏｍｅｓ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｅｌｏｎａｌｉｔｙ ［Ｊ］．Ｖｉｏｒｌｏｇｙ，２００７，３５７：１７５—１８５． ［３］萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔Ｄ ｗ．分子克隆实验指南［Ｍ］．３版．北京：科学出版社，２００２． ［４］ＦＥＮＡＵＸ Ｍ，ＨＡＬＢＵＲ Ｐ Ｇ，ＧＩＬＬ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ２ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｃｇｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＰＣＲ－・ｒｅｓｔｒｉｃ・－ ｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＰＣＶ一１ ａｎｄ ＰＣＶ－２［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌ，２００ｏ，３８：２４９４—２５０３． ［５］ＬＡＲＯＣＨＥＬＬＥ Ｒ，ＭＡＧＡＲ Ｒ Ｄ，ＡＬＬＡＩＲＥ Ｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｎａｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｒｆｏｍ ｃａｓｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｖａｌ＇ｉｏ１．１Ｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，２００２，９０：１０１—１ １２． ［６］朱善元，赵海坤，成大荣，等．猪圆环病毒２型的ＰＣＲ快速检测及其临床应用［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２００８，４３（６）：２９—３２． ［７］ＹＡＮＣ ２ ２，ＳＨＵＡＮ Ｊ Ｂ，ＤＡＩ Ｘ Ｊ．ｅｔ ａ１．Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｎ ｏｐｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｍｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｉｔｓ ＯＲＦ２ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｂ，２００８，９（２）：１４８—１５３． ［８］ＬＩＵ Ｑ，１１ＫＯ０ Ｓ Ｋ，ＢＡＢＩＵＫ Ｌ Ａ．Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＯＲＦ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２００１，２８５（１）：９１～９９． ［９］ＭＡＨＥ Ｄ，ＢＬＡＮＣＨＡＲＤ Ｐ，ＴＲＵＯＮＧ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＯＲＦ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅｌ ａｎｄ ｔｙｐｅ２ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒ－ ＵＳ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｒｅｌｅｖａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２０００，８（７）：１８１５—１８２４． （责任编辑：施晓棠）
